Etikettenfreier Immunpräzipitations-Massenspektrometrie-Workflow für großangelegtes Nuklear-Interactome-Profiling
Summary
Described ist ein Proteomik-Workflow zur Identifizierung von Proteininteraktionspartnern aus einer nuklearen subzellulären Fraktion mithilfe der Immunaffinitätsanreicherung eines bestimmten Proteins von Interesse und der etikettenfreien Massenspektrometrie. Der Workflow umfasst subzelluläre Fraktionierung, Immunpräzipitation, filtergestützte Probenvorbereitung, Offline-Bereinigung, Massenspektrometrie und eine nachgelagerte Bioinformatik-Pipeline.
Abstract
Die Immunaffinitätsreinigungsmassenspektrometrie (IP-MS) hat sich als robuste quantitative Methode zur Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen herausgebildet. Diese Publikation stellt einen vollständigen Workflow für Interaktionsproteomik dar, der entwickelt wurde, um proteinarme Protein-Protein-Wechselwirkungen aus dem Zellkern zu identifizieren, die auch auf andere subzelluläre Kompartimente angewendet werden könnten. Dieser Workflow umfasst subzelluläre Fraktionierung, Immunpräzipitation, Probenvorbereitung, Offline-Bereinigung, einschussfreie Massenspektrometrie sowie nachgeschaltete Rechenanalyse und Datenvisualisierung. Unser Protokoll ist für die Detektion von kompartifalisierten Wechselwirkungen mit geringer Häufigkeit optimiert, die von ganzen Zelllysaten (z. B. Transkriptionsfaktor-Wechselwirkungen im Zellkern) durch Immunpräzipation endogenes Proteine aus fraktionierte subzelluläre Fächer. Die hier skizzierte Probenvorbereitungspipeline enthält detaillierte Anweisungen für die Herstellung von HeLa-Zellkernextrakt, die Immunaffinitätsreinigung von endogenem Köderprotein und die quantitative Massenspektrometrieanalyse. Wir diskutieren auch methodische Überlegungen zur Durchführung großangelegter Immunpräzipitation in Massenspektrometrie-basierten Interaktionsprofilierungsexperimenten und geben Richtlinien für die Bewertung der Datenqualität, um echtes positives Protein zu unterscheiden. Wechselwirkungen aus unspezifischen Interaktionen. Dieser Ansatz wird hier demonstriert, indem das nukleare Interaktivom der CMGC-Kinase DYRK1A untersucht wird, eine Proteinkinase mit geringer Häufigkeit mit schlecht definierten Wechselwirkungen innerhalb des Kerns.
Introduction
Das menschliche Proteom weist durch die Bildung stabiler Multisubunit-Komplexe und transienter Protein-Protein-Wechselwirkungen eine enorme strukturelle und biochemische Vielfalt auf. Dementsprechend ist die Identifizierung von Interaktionspartnern für ein Protein von Interesse in Untersuchungen häufig erforderlich, um molekulare Mechanismen zu entwirren. Jüngste Fortschritte bei Affinitätsreinigungsprotokollen und das Aufkommen hochauflösender Schnellscan-Massenspektrometrie-Instrumente haben eine einfache Kartierung von Proteininteraktionslandschaften in einem einzigen unvoreingenommenen Experiment ermöglicht.
Protein-Interaktionsprotokolle verwenden häufig ektopische Expressionssysteme mit Affinitäts-getaggten Fusionskonstrukten, um Protein-Wechselwirkungen zu identifizieren, ohne dass hochwertige Antikörper benötigt werden, die ein Protein von Interesse erkennen1,2. Epitop-Tag-basierte Methoden haben jedoch mehrere Nachteile. Physikalische Wechselwirkungen mit dem Epitop können zum Nachweis unspezifischer koreinigender Proteine führen3. Zusätzlich kann die Fusion dieser Epitop-Tags zum N- oder C-Terminal eines Proteins native Protein-Protein-Wechselwirkungen blockieren oder die Proteinfaltung stören, um nicht-physiologische Konformationen zu fördern4. Darüber hinaus überprimieren ektopische Expressionssysteme das Köderprotein in der Regel in supraphysiologischen Konzentrationen, was zur Identifizierung von artefaktischen Proteinwechselwirkungen führen kann, insbesondere bei dosisempfindlichen Genen5. Um diese Probleme zu umgehen, kann das endogene Köderprotein zusammen mit den damit verbundenen interagierenden Beuteproteinen immunpräzipiert werden, vorausgesetzt, es steht ein hochwertiger Antikörper zur Verfügung, der das native Protein erkennt.
Hier ist ein Interaktionsproteomik-Workflow zum Nachweis des nuklearen Interkolonms eines endogene Proteins am Beispiel der CMGC-Proteinkinase DYRK1A vorgesehen. Störung der DYRK1A Kopiernummer, Aktivitätsniveau oder Ausdruck kann schwere geistige Behinderung beim Menschen verursachen, und embryonale Letalität bei Mäusen6,7,8,9. DYRK1A weist eine dynamische raumzeitliche Regulation10und kompartalisierte Proteinwechselwirkungen11,12auf, die Ansätze erfordern, die in der Lage sind, Interaktionspartner mit geringer Häufigkeit zu erkennen, die für verschiedene subzelluläre Kompartimente spezifisch sind.
Dieses Protokoll verwendet die zelluläre Fraktionierung menschlicher HeLa-Zellen in Zytosol- und Nukleoplasmafraktionen, Immunpräzipitation, Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie und einen Überblick über eine bioinformatische Pipeline zur Auswertung der Datenqualität und zur Visualisierung von Ergebnissen, wobei R-Skripte für die Analyse und Visualisierung bereitgestellt werden (Abbildung 1). Proteomics-Softwarepakete, die in diesem Workflow verwendet werden, stehen alle frei zum Download zur Verfügung oder können über eine Web-Oberfläche aufgerufen werden. Weitere Informationen zu Software und Rechenmethoden finden Sie unter den bereitgestellten Links.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der hier skizzierte Proteomik-Workflow bietet eine effektive Methode zur Identifizierung von proteinreichen Proteininteraktoren für ein Protein von Interesse. Dieser Ansatz verringert die Probenkomplexität durch subzelluläre Fraktion und konzentriert sich auf die Erhöhung der Identifikationsinteraktionspartner durch robuste Probenvorbereitung, Offline-Probenbereinigung und strenge Qualitätskontrolle des LC-MS-Systems. Die hier beschriebene nachgelagerte Datenanalyse ermöglicht eine einfache statistische Auswertung der Proteine, die als mit dem Köder koreinigend identifiziert wurden. Aufgrund einer hohen Anzahl experimenteller Variablen (Skala, Zelllinie, Antikörperwahl) erfordert jedes Experiment jedoch unterschiedliche Cutoffs und Überlegungen zur Datenvisualisierung und -anreicherung.
Die erste Design-Überlegung in einem IP-MS-Experiment ist die Auswahl von Antikörpern, die zusammen mit ihren interagierenden Partnern zur Koreinigung des von Interesse interessierten Proteins verwendet werden. Während die Verfügbarkeit kommerzieller Antikörper in den letzten Jahrzehnten auf größere Teile des menschlichen Proteoms ausgeweitet wurde, gibt es immer noch viele Proteine, für die Reagenzien begrenzt sind. Darüber hinaus können Antikörper, die für Anwendungen wie den Western-Blot-Nachweis validiert wurden, in einem Immunpräzipationsexperiment nicht in der Lage sein, das Zielprotein selektiv anzureichern. Vor der Durchführung eines groß angelegten Interaktionsproteomik-Experiments wird vorgeschlagen, eine IP von einer 90% konfluenten 10 cm Schale oder einer gleichwertigen Zellnummer abzuschließen und das Zielprotein von Interesse durch Western Blotting zu untersuchen. Wenn mehr als ein einziger Antikörper für Immunpräzipitation verfügbar ist, wird zusätzlich vorgeschlagen, mehrere Antikörper auszuwählen, die Epitope in verschiedenen Teilen des Proteins erkennen. Die Bindung eines Antikörpers an ein Köderprotein kann die notwendige Bindungsschnittstelle für vermeintlich eimierende Partner ausblenden. Die Auswahl eines sekundären Epitops für das Köderprotein erhöht die Abdeckung des Interaktionsprofils, das durch ein Experiment auf Derspektrometrie identifiziert wird.
Eine zweite wichtige Überlegung liegt in der Auswahl der geeigneten Kontrolle, um vertrauensbesonnene Wechselwirkungen von vertrauensarmen oder unspezifischen Wechselwirkungen von solchen zu unterscheiden, die als mit dem Köder koeiniger identifiziert wurden. Die strengste Kontrolle für ein IP-MS-Experiment besteht darin, die Immunpräzipitation aus einer CRISPR KO-Zelllinie des Köders abzuschließen. Eine solche Kontrolle ermöglicht die Identifizierung und Filterung von unspezifischen Proteinen, die direkt an den Antikörper und nicht an das Köderprotein binden. In Fällen, in denen die Erzeugung einer CRISPR KO-Zelllinie jedes Köderproteins nicht möglich ist, kann eine IgG-Perlenkontrolle desselben Isotyps des Köderantikörpers verwendet werden. In Experimenten, die ein Panel von Antikörpern verwenden, die mehrere Arten darstellen, kann die Verwendung einer Perlen-Only-Kontrolle angemessen sein, erhöht aber die Rate der falsch positiven Ergebnisse, die als hochvertrauensgefährdete Interaktoren identifiziert wurden.
Die Auswahl der in einem IP-MS-Experiment verwendeten Zelllinie hängt von mehreren Schlüsselfaktoren ab. Proteinexpression und Lokalisation sind weitgehend vom Zelltyp abhängig. Während für die meisten Gene in vielen häufig verwendeten Zelllinien RNA-Expressionsschätzungen gefunden werden können, ist die Proteinexpression schlecht mit der RNA-Expression korreliert und muss experimentell bestimmt werden25. Zelllinien, in denen ein Köderprotein in sehr geringer Kopierzahl exprimiert wird, sollten vermieden werden, um Probleme zu umgehen, die mit drastischen Erhöhungen der Zellkulturskala verbunden sind, die erforderlich sein können. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die Probenvorbereitung für den Nachweis von Proteinen mit sehr geringer Häufigkeit optimiert werden kann. Die FASP-Methode (Filter Aided Sample Prep) ist robust, kann aber zu einem Peptidverlust von mehr als 50 % in einer Probe führen. Die Single-Pot Solid-Phase-Enhanced Sample Preparation (SP3) ist eine effiziente Methode zur Generierung von Proben für die Massenspektrometrieanalyse, die den Probenverlust minimiert26. Die erhöhte Rückgewinnung, die durch die SP3-Methode der Probenvorbereitung ermöglicht wird, kann eine nützliche Alternative in diesem Workflow für die Quantifizierung von Proteinen sein, die in die Nähe der Nachweisgrenze fallen.
Dieser Proteomik-Workflow wurde in vielen Kernködern angewendet, einschließlich Kiinasen, E3-Ubiquitin-Ligasen und Gerüstbestandteilen von Multisubunit-Komplexen. Unter der Annahme einer ordnungsgemäßen Validierung von Antikörperreagenzien führt die erfolgreiche Ausführung dieses Workflows zum Nachweis von proteinreichen Partnern für kernkraft für ein Protein von Interesse.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Grand Challenge-Stipendium an W.M.O. vom Linda Crnic Institute for Down-Syndrom und durch eine DARPA-Kooperationsvereinbarung 13-34-RTA-FP-007 unterstützt. Wir danken Jesse Kurland und Kira Cozzolino für ihre Beiträge zur Lektüre und Kommentierung des Manuskripts.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 ml low-rention microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| 4-20% Mini PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561096 | |
| acetone (HPLC) | Thermo Fisher Scientific | A949SK-4 | |
| Amicon Ultra 0.5 ml 30k filter column | Millipore Sigma | UFC503096 | |
| Benzamidine | Sigma-Aldrich | 12072 | |
| benzonase | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| Dialysis tubing closure | Caroline Biological Supply Company | 684239 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | Sc-47724 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 887845 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| HeLa QC tryptic digest | Pierce | 88329 | |
| HEPES | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
| insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| KONTES Dounce homogenizer 7 ml | VWR | KT885300-0007 | |
| Large Clearance pestle 7ml | VWR | KT885301-0007 | |
| Lysyl endopeptidase C | VWR | 125-05061 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Microcystin | enzo life sciences | ALX-350-012-C100 | |
| Nonidet P 40 Substitute solution | Sigma-Aldrich | 98379 | |
| p84 antibody | GeneTex | GTX70220 | |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Pierce BSA Protein Digest, MS grade | Thermo Fisher Scientific | 88341 | LCMS QC |
| Pierce C18 spin columns | Thermo Fisher Scientific | PI-89873 | |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Fisher Scientific | 90057 | For mass spectrometry sample prep |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0780-01 | |
| Protein G Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0618-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Silica emitter tip | Pico TIP | FS360-20-10 | |
| Small Clearance pestle 7ml | VWR | KT885302-0007 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | 31448 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Spectra/ Por 8 kDa 24 mm dialysis tubing | Thomas Scientific | 3787K17 | |
| TC Dish 150, Standard | Sarstedt | 83.3903 | Tissue culture dish for adherent cells |
| TCA | Sigma-Aldrich | T9159 | |
| TCEP | Thermo Scientific | PG82080 | |
| TFA | Thermo Fisher Scientific | 28904 | |
| Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS | Thermo Fisher Scientific | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | 29700 | |
| Waters ACQUITY M-Class UPLC | Waters | ||
| Waters ACQUITY UPLC M-Class Column Reversed-Phase 1.7µm Spherical Hybrid (1.7 µm, 75 µm x 250 mm) | Waters | 186007484 | nanoflow C18 column |
References
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