التسمية خاليه ايمونوبريسيبيتيشن الطيف الطيفي سير العمل لتحديد المواقع النووية علي نطاق واسع التنميط
Summary
وصف هو سير العمل البروتيني لتحديد الشركاء تفاعل البروتين من كسر الخلوية النووية باستخدام التخصيب المناعي للبروتين معين من الفائدة والطيف الكتلة خاليه من التسمية. يتضمن سير العمل التجزئة الخلوية ، والايمونوبريسيبيتيشن ، واعداد العينة بمساعده الفلتر ، والتنظيف دون اتصال ، وقياس الطيف الكتلي ، وخط أنابيب المعلوماتية الحيوية المصب.
Abstract
وقد برز مقياس الطيف الكتلي لتنقيه المناعة (IP-MS) كطريقه كميه قويه للتعرف علي تفاعلات البروتين والبروتين. يقدم هذا المنشور التفاعل الكامل بروميكس سير العمل المصممة لتحديد التفاعلات البروتينية البروتين منخفضه الوفرة من النواة التي يمكن أيضا ان تطبق علي مقصورات فرعيه أخرى. يتضمن سير العمل هذا تجزئه الخلايا الفرعية ، والايمونوبريسيبيتيشن ، واعداد العينات ، والتنظيف دون اتصال ، وقياس الطيف الكتلي الخالي من التسمية ، والتحليل الحسابي المصب والتصور المرئي للبيانات. تم تحسين بروتوكولنا للكشف عن التفاعلات المجزاه والمنخفضة الوفرة التي يصعب التعرف عليها من الخلايا الكاملة (علي سبيل المثال ، تفاعلات عامل النسخ في النواة) عن طريق ايمونوبريسيبيتيشن البروتينات الذاتية من مقصورات الخلايا الفرعية مجزاه. خط أنابيب اعداد عينه المبينة هنا يوفر تعليمات مفصله لاعداد استخراج النووية الخلية هيلا ، وتنقيه المناعة من البروتين الطعم الذاتي ، وتحليل الطيف الكتلي الكمي. ونحن نناقش أيضا الاعتبارات المنهجية لأداء الايمونوبريسيبيتيشن واسعه النطاق في التفاعل القائم علي الطيف الطيفي التجارب وتوفير المبادئ التوجيهية لتقييم جوده البيانات لتمييز البروتين الإيجابي الحقيقي تفاعلات من تفاعلات غير محدده. ويتجلى هذا النهج هنا من خلال التحقيق في التفاعل النووي لل CMGC كيناز, DYRK1A, بروتين كيناز منخفضه الوفرة مع التعاملات المحددة بشكل سيئ داخل النواة.
Introduction
البروتينية البشرية المعارض التنوع الهيكلي والبيوكيميائية واسعه من خلال تشكيل المجمعات المتعددة الوحدات مستقره والتفاعلات البروتين والبروتين عابره. ووفقا لذلك ، فان تحديد الشركاء التفاعل للبروتين من الفائدة مطلوب عاده في التحقيقات لكشف اليه الجزيئية. وقد مكنت التطورات الاخيره في بروتوكولات تنقيه التقارب وظهور أجهزه قياس الطيف الكتلي عاليه الاستبانة من المسح السهل للمناظر الطبيعية للتفاعل البروتيني في تجربه واحده غير متحيزة.
بروتوكولات تفاعل البروتين تستخدم عاده أنظمه التعبير عن الرحم مع ثوابت الانصهار الموسومة التقارب لتحديد التفاعلات البروتين دون الحاجة إلى الأجسام المضادة عاليه الجودة الاعتراف بروتين من الفائدة1,2. ومع ذلك ، فان الأساليب القائمة علي علامات المرمه لها عيوب عديده. التفاعلات الفيزيائية مع المرقد يؤدي إلى الكشف عن البروتينات النحاسية غير المحددة3. بالاضافه إلى ذلك ، فان انصهار هذه العلامات المرطيه إلى N-أو C-الطرفية للبروتين قد يمنع تفاعلات بروتين البروتين الاصليه ، أو يعطل طي البروتين لتعزيز التشكيلات غير الفسيولوجية4. وعلاوة علي ذلك, نظم التعبير عن الرحم عاده overexpress البروتين الطعم في تركيزات سوبرافيسيولوجيكال, التي يمكن ان تؤدي إلى تحديد التفاعلات البروتين المادي, لا سيما بالنسبة للجينات الحساسة للجرعة5. للالتفاف علي هذه القضايا ، يمكن ان إيمونوبريسيبيتاتيد البروتين الطعم الذاتية مع المرتبطة البروتينات فريسه التفاعل ، علي افتراض توافر الأجسام المضادة عاليه الجودة التي تعترف البروتين الأصلي.
المقدمة هنا هو التفاعل البروتينية سير العمل للكشف عن interactome النووية من البروتين الذاتي باستخدام البروتين CMGC كيناز DYRK1A كمثال. تعطيل رقم النسخة الDYRK1Aه ، مستوي النشاط ، أو التعبير يمكن ان يسبب أعاقه ذهنيه شديده في البشر ، والفتك الجنيني في الفئران6،7،8،9. DYRK1A يسلك التنظيم المكاني الديناميكي10، والتفاعلات البروتينية مجزاه11،12، تتطلب نهج قادره علي الكشف عن الشركاء التفاعل منخفضه الوفرة محدده لمقصورات فرعيه مختلفه.
يستخدم هذا البروتوكول التجزئة الخلوية للخلايا البشرية هيلا في الكسور السيتوزول والنيوتوبلاسما ، والايمونوبريسيبيتيشن ، واعداد العينة لقياس الطيف الكتلي ، ونظره عامه علي خط أنابيب المعلوماتية الحيوية لتقييم جوده البيانات وتصور النتائج ، مع نصوص R المقدمة للتحليل والتصور (الشكل 1). حزم البرامج البروتينية المستخدمة في سير العمل هذه كلها متاحه بحريه للتحميل أو يمكن الوصول اليها من خلال واجهه ويب. للحصول علي معلومات اضافيه حول البرامج والأساليب الحسابية ، والدروس المتعمقة والتعليمات المتاحة في الروابط المقدمة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر سير العمل البروتيني الموضح هنا طريقه فعاله للتعرف علي العوامل البروتينية ذات الثقة العالية للحصول علي بروتين من الفائدة. هذا النهج يقلل من تعقيد العينة من خلال كسر الخلايا الخلوية ويركز علي زيادة الشركاء التفاعل التعرف من خلال اعداد عينه قويه ، دون اتصال عينه تنظيف ، ومراقبه الجودة الصارمة لنظام LC-MS. تحليل البيانات المصب الموصوف هنا يسمح للتقييم الإحصائي البسيط للبروتينات التي تم تحديدها علي انها الطعم. ومع ذلك ، ونظرا للعدد الكبير من المتغيرات التجريبية (المقياس ، وخط الخلية ، واختيار الأجسام المضادة) ، فان كل تجربه تتطلب عمليات قطع مختلفه واعتبارات تتعلق بتصور البيانات وإثراءها.
أول اعتبار للتصميم في تجربه الملكية الفكرية-MS هو اختيار الأجسام المضادة التي سيتم استخدامها لتجسيد البروتين المثير للاهتمام مع شركائها المتفاعلين. في حين ان توافر الأجسام المضادة التجارية قد اتسع لتغطيه أجزاء أكبر من بروتينيه البشرية علي مدي العقود القليلة الماضية ، لا يزال هناك العديد من البروتينات التي الكواشف محدوده. وعلاوة علي ذلك ، قد تكون الأجسام المضادة التي تم التحقق من صحتها للتطبيقات مثل الكشف عن لطخه الغربية غير قادره علي إثراء انتقائي للبروتين المستهدف في تجربه ايمونوبريسيبيتيشن. قبل اجراء تجربه التفاعل البروتيني علي نطاق واسع ، ويقترح لاستكمال الملكية الفكرية من 90 ٪ متموج 10 سم طبق ، أو ما يعادلها رقم الخلية ، والتحقيق للبروتين الهدف من الفائدة الغربية التنقيط. إذا كان أكثر من الأجسام المضادة واحده متاحه لايمونوبريسيبيتيشن, ويقترح بالاضافه إلى ذلك لتحديد الأجسام المضادة المتعددة الاعتراف مرتوب داخل أجزاء مختلفه من البروتين. يمكن ان اوككلودي ربط الأجسام المضادة ببروتين الطعم واجهه الربط اللازمة للشركاء المتفاعلين المفترضين. سيؤدي اختيار الكمية الثانوية للبروتين الطعم إلى زيادة تغطيه التفاعل الذي حددته التجربة المستندة إلى الطيف الكتلي.
ويكمن الاعتبار الرئيسي الثاني في اختيار السيطرة المناسبة للتمييز بين التفاعلات ذات الثقة العالية والتفاعلات المنخفضة الثقة أو غير المحددة من تلك التي تم تحديدها علي انها الطعم. التحكم الأكثر صرامة لتجربه الملكية الفكرية-MS هو لإكمال الايمونوبريسيبيتيشن من خط خليه CRISPR KO من الطعم. مثل هذا التحكم يتيح تحديد وتصفيه من البروتينات غير المحددة التي ترتبط مباشره إلى الأجسام المضادة بدلا من البروتين الطعم. في الحالات التي يكون فيها توليد خط الخلية CRISPR KO من كل البروتين الطعم غير ممكن ، ويمكن استخدام السيطرة مفتش الخرزة من نفس النمط من الأجسام المضادة الطعم. في التجارب التي تستخدم لوحه من الأجسام المضادة التي تمثل أنواع متعددة ، يمكن ان يكون استخدام التحكم بالخرز فقط مناسبا ولكنه سيزيد من معدل الإيجابيات الزائفة التي تم تحديدها كاطراف ذات ثقة عاليه.
يعتمد اختيار خط الخلية المستخدم في تجربه IP-MS علي عده عوامل رئيسيه. يعتمد تعبير البروتين والتعريب إلى حد كبير علي نوع الخلية. بينما [رنا] تعبير تقديرات يستطيع كنت أسست لمعظم مورثات في كثير يشيع يستعمل خليه خطوط, بروتين ارتبطت تعبير بضعف مع [رنا] تعبير وينبغي كنت حددت تجريبيا25. وينبغي تجنب الخطوط الخلوية التي يتم فيها التعبير عن البروتين الطعم في عدد منخفض جدا من النسخ للالتفاف علي المشاكل المرتبطة بالزيادات الحاده في نطاق ثقافة الخلية التي قد تكون مطلوبه. وتجدر الاشاره ، مع ذلك ، ان اعداد العينة يمكن ان يكون الأمثل للكشف عن البروتينات وفره منخفضه جدا. بمساعده فلتر عينه الاعداديه (FASP) الأسلوب ، في حين قويه ، يمكن ان يسبب فقدان أكثر من 50 ٪ من الببتيد في عينه. وتعد عمليه اعداد العينات ذات المرحلة الصلبة المعززة بالطور الواحد (SP3) طريقه فعاله لتوليد العينات لتحليل قياس الطيف الكتلي الذي يقلل من فقدان العينات26. يمكن ان يكون الاسترداد المتزايد الذي تم تمكينه بواسطة أسلوب SP3 لاعداد العينات بديلا مفيدا في سير العمل هذا للقياس الكمي للبروتينات التي تقع بالقرب من حد الكشف.
وقد تم تطبيق هذا العمل بروتينيه عبر العديد من الطعوم النووية, بما في ذلك كيناسيس, E3 اوبيكويتين ligases, والسقالات أعضاء المجمعات متعددة الوحدات الفرعية. علي افتراض التحقق السليم من الكواشف الأجسام المضادة ، فان التنفيذ الناجح لسير العمل هذا سيؤدي إلى الكشف عن شركاء التفاعل النووي البروتين عاليه الثقة للبروتين من الفائدة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان هذا العمل مدعوما بمنحه التحدي الكبير لW.M.O. من معهد ليندا كرانك لمتلازمة داون وببموجب اتفاقيه تعاونيه في داربا 13-34-RTA-FP-007. نود ان نشكر جيسي كورلاند وكيرا كوتزيينو علي مساهماتهم في القراءة والتعليق علي المخطوطة.
Materials
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 ml low-rention microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| 4-20% Mini PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561096 | |
| acetone (HPLC) | Thermo Fisher Scientific | A949SK-4 | |
| Amicon Ultra 0.5 ml 30k filter column | Millipore Sigma | UFC503096 | |
| Benzamidine | Sigma-Aldrich | 12072 | |
| benzonase | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| Dialysis tubing closure | Caroline Biological Supply Company | 684239 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | Sc-47724 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 887845 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| HeLa QC tryptic digest | Pierce | 88329 | |
| HEPES | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
| insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| KONTES Dounce homogenizer 7 ml | VWR | KT885300-0007 | |
| Large Clearance pestle 7ml | VWR | KT885301-0007 | |
| Lysyl endopeptidase C | VWR | 125-05061 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Microcystin | enzo life sciences | ALX-350-012-C100 | |
| Nonidet P 40 Substitute solution | Sigma-Aldrich | 98379 | |
| p84 antibody | GeneTex | GTX70220 | |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Pierce BSA Protein Digest, MS grade | Thermo Fisher Scientific | 88341 | LCMS QC |
| Pierce C18 spin columns | Thermo Fisher Scientific | PI-89873 | |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Fisher Scientific | 90057 | For mass spectrometry sample prep |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0780-01 | |
| Protein G Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0618-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Silica emitter tip | Pico TIP | FS360-20-10 | |
| Small Clearance pestle 7ml | VWR | KT885302-0007 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | 31448 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Spectra/ Por 8 kDa 24 mm dialysis tubing | Thomas Scientific | 3787K17 | |
| TC Dish 150, Standard | Sarstedt | 83.3903 | Tissue culture dish for adherent cells |
| TCA | Sigma-Aldrich | T9159 | |
| TCEP | Thermo Scientific | PG82080 | |
| TFA | Thermo Fisher Scientific | 28904 | |
| Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS | Thermo Fisher Scientific | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | 29700 | |
| Waters ACQUITY M-Class UPLC | Waters | ||
| Waters ACQUITY UPLC M-Class Column Reversed-Phase 1.7µm Spherical Hybrid (1.7 µm, 75 µm x 250 mm) | Waters | 186007484 | nanoflow C18 column |
References
- Varjosalo, M., et al. The protein interaction landscape of the human CMGC kinase group. Cell Reports. 3, 1306-1320 (2013).
- Kimple, M. E., Brill, A. L., Pasker, R. L. Overview of Affinity Tags for Protein Purification. Current Protocols in Protein Science. 73, (2013).
- Mahmood, N., Xie, J. An endogenous ‘nonspecific’ protein detected by a His-tag antibody is human transcription regulator YY1. Data in Brief. 2, 52 (2015).
- Zordan, R. E., Beliveau, B. J., Trow, J. A., Craig, N. L., Cormack, B. P. Avoiding the ends: internal epitope tagging of proteins using transposon Tn7. Genetics. 200, 47-59 (2015).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10, 715-721 (2013).
- Bronicki, L. M., et al. Ten new cases further delineate the syndromic intellectual disability phenotype caused by mutations in DYRK1A. European Journal of Human Genetics. 23, 1482-1487 (2015).
- Antonarakis, S. E. Down syndrome and the complexity of genome dosage imbalance. Nature Reviews Genetics. , (2016).
- Dowjat, W. K., et al. Trisomy-driven overexpression of DYRK1A kinase in the brain of subjects with Down syndrome. Neuroscience Letters. 413, 77-81 (2007).
- Fotaki, V., et al. Dyrk1A haploinsufficiency affects viability and causes developmental delay and abnormal brain morphology in mice. Molecular and Cellular Biology. 22, 6636-6647 (2002).
- Hämmerle, B., Elizalde, C., Tejedor, F. J. The spatio-temporal and subcellular expression of the candidate Down syndrome gene Mnb/Dyrk1A in the developing mouse brain suggests distinct sequential roles in neuronal development. European Journal of Neuroscience. 27, 1061-1074 (2008).
- Funakoshi, E., et al. Overexpression of the human MNB/DYRK1A gene induces formation of multinucleate cells through overduplication of the centrosome. BMC Molecular and Cell Biology. 4, 12 (2003).
- Yu, D., Cattoglio, C., Xue, Y., Zhou, Q. A complex between DYRK1A and DCAF7 phosphorylates the C-terminal domain of RNA polymerase II to promote myogenesis. Nucleic Acids Research. , 1-14 (2019).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11, 2301-2319 (2016).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13, 731-740 (2016).
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: A contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10, 730-736 (2013).
- Choi, H., et al. SAINT: Probabilistic scoring of affinity purificationg-mass spectrometry data. Nature Methods. 8, 70-73 (2011).
- Shannon, P., et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research. 13, 2498-2504 (2003).
- Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45, 362-368 (2017).
- Bindea, G., et al. ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks. Bioinformatics. 25, 1091-1093 (2009).
- Guard, S. E., et al. The nuclear interactome of DYRK1A reveals a functional role in DNA damage repair. Scientific Reports. 9, 6539 (2019).
- Razick, S., Magklaras, G., Donaldson, I. M. iRefIndex: A consolidated protein interaction database with provenance. BMC Bioinformatics. 9, 405 (2008).
- Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells. Nature Methods. 11, 319-324 (2014).
- Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance. Cell. 165, 535-550 (2016).
- Hughes, C. S., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10, 757 (2014).
