Label-vrije Immunoprecipitation massaspectrometrie workflow voor grootschalige nucleaire interactome profilering

Opmerking: alle buffercomposities en protease mengsels worden beschreven in tabel 1. 1. bereiding van de cellen Opmerking: voor deze immunoprecipitatie massaspectrometrie (IP-MS) benadering is een uitgangsmateriaal van 1 − 10 mg nucleair lysaat per replicaat gewenst. Er worden celhoeveelheden gegeven voor 1 mg nucleaire immunoprecipitaties in drievloeiingen plus triplicaat-controles. Bij gebruik van een aanhandige cellijn, groeien de cellen tot 90% confluentie in 3 x 15 cm gerechten per repliceren voorafgaand aan het oogsten.Opmerking: het wordt aanbevolen om minimaal drie replicaatimmunoprecipitaties uit te voeren voor aas-en controle omstandigheden. In dit protocol wordt uitgegaan van het gebruik van ‘ kralen alleen ‘ besturingselementen, die bepalen voor overvloedige niet-specifieke interacties met de kralen, beginnend bij rubriek 4. Andere soorten besturingselementen kunnen nuttig zijn. Deze worden uitvoerig beschreven in de sectie discussie. Was de platen 2x met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en trypsinize-cellen met 3 mL 0,25% trypsine per 15 cm plaat. Draai de cellen gedurende 5 minuten op 1.200 x g en decaner de trypsine. Voor suspensie cellen, groeien tot een vergelijkbare schaal/dichtheid te bereiken 70 − 80 mg totaal eiwit. Pellet cellen bij 1.200 x g en 4 °c gedurende 5 min. decanteren de media zorgvuldig.Opmerking: pellets kunnen tijdens deze stap worden gecombineerd om efficiënte verwerking mogelijk te maken met behulp van de grootschalige subcellulaire fractionering zoals beschreven in sectie 2. Was de celpellet 2x met PBS + 5 mM MgCl2 aangevuld met proteaseremmers (pi’s) en fosfatase remmers (PhIs) (Zie tabel 1).Opmerking: Celpellets kunnen in vloeibare stikstof worden bevroren en bij-80 °C worden bewaard tot ze klaar zijn voor fractionering. 2. bereiding van nucleair extract Opmerking: protease-en fosfatase remmers moeten worden toegevoegd aan de fractionering buffers binnen 30 min. gebruik. Indien bevroren, ontdooien de celpellets 15 min in 1x pellets volume van koude buffer A + Pi’s/PhIs. Plaats de celpellet op een nutator bij 4 °C om tijdens het ontdooien te helpen bij het resuspensie. Anders, respendeer de celpellet van stap 1,3 in 1x pellet volume buffer A + Pi’s/PhIs. Pellet bij 2.000 x g en 4 °c gedurende 10 min. de buffer decaneren. Onderbreek de cellen met 5x het verpakte celvolume met buffer A en incuberen op ijs gedurende 20 minuten. Pellet bij 2.000 x g en 4 °c gedurende 10 min. decaneren de buffer en hervatten met 2x originele verpakte celvolume buffer A + Pi’s/PhIs en dounce ~ 7X met “A”/losse stamper. Centrifugeer het lysaat gedurende 10 minuten bij 2.000 x g en 4 °c. Pipetteer voorzichtig de supernatant en vlam met vloeibare stikstof. Bewaar het lysaat bij-80 °c. De supernatant van deze stap is de cytosolische subcellulaire Fractie.Opmerking: de nucleaire pellet kan tijdens deze stap worden opgeslagen door Flash te bevriezen met vloeibare stikstof en op-80 °C te bewaren Rebreng de pellet met 0,9 x pellet volume van buffer B + Pi’s/PhIs en meng op een nutator gedurende 5 minuten bij 4 °C. Om de kernen te lyseren, dounce 20x met een strakkere stamper “B”. Meng het nucleaire lysaat op een nutator gedurende 30 minuten bij 4 °c, zodat het homogeen is. Centrifugeer het nucleaire lysaat gedurende 30 minuten bij 21.000 x g bij 4 °c. Pipetteer het supernatant en bewaar als een oplosbaar nucleair eiwitextract.Opmerking: Nuclease behandeling van de resulterende nucleaire pellet maakt het mogelijk voor het herstel van een chromatine-geassocieerde eiwitfractie. Dialyseer het oplosbare nucleaire extract tegen buffer C + Pi’s gedurende 3 uur bij 4 °C. Snijd een passende lengte van 24 mm breedte dialyse slang met een 8 kDa molecuulgewicht afgesneden. Klem één kant van de slang en load nucleoplasm in de buis. Na het laden van het lysaat, klem het andere uiteinde en onderdompelen in een schone glazen container met buffer C + Pi’s. Centrifugeer het gedialyseerde nucleair extract/nucleoplasma bij 4 °C tot 21.000 x g , gedurende 30 min. aliquot 3X 20 μL kern extract voor fractionering validering door Western Blot. Het nucleaire extract dat voor IP-MS-analyse wordt gebruikt, kan worden alicgeciteerd en in vloeibare stikstof worden bevroren en bij-80 °C worden opgeslagen, indien nodig. 3. validering van subcellulaire fractionering Voltooi een eiwit test om de eiwitconcentratie van het nucleaire lysaat te bepalen. Een bicinchonininezuur eiwit test biedt voldoende gevoeligheid voor downstreamtoepassing. Laad 20 μg van zowel de cytosolische als de nucleaire fracties op een SDS-PAGE gel voor de Western Blot-analyse zoals eerder beschreven13. Skip Lanes bij het laden om te voorkomen dat een monster te vermijden. Test de Western Blot voor p84 (THOC1) als een nucleaire marker en GAPDH als een cytosolische marker. Bepaal de mate van fractionering door de verhouding van de cytosolische marker in de nucleaire Fractie en omgekeerd.Opmerking: er kunnen antilichamen voor andere nucleaire en cytosolische markers worden gebruikt. 4. immunoprecipitatie van endogene kern aas eiwit Opmerking: het wordt aanbevolen om vanaf dit punt lage retentie buizen te gebruiken. Hierdoor wordt de niet-specifieke binding aan de buizen tijdens het hanteren van het monster verminderd en wordt onnodig verlies van monster vermeden. Zorg er bovendien voor dat LCMS grade H2O wordt gebruikt om buffers voor te bereiden voor de resterende stappen. Bereid een proteïne-A/G-kraal mengsel voor elke replicaat door een kraal volume van 12,5 μL te combineren voor zowel proteïne-A als proteïne-G in micro centrifugebuizen. Bewaar de kraal voorraden als een slurry met 20% ethanol. Bepaal de concentratie van kralen binnen de slurry% (v/v) en Pipetteer het benodigde volume met behulp van een pipetpunt dat is uitgesneden op de punt om ervoor te zorgen dat de kralen de punt kunnen betreden. Was het eiwit A/G kraal mengsel 2x met 300 μL IP buffer 1. Spin de parels op 1.500 x g bij 4 °c gedurende 1 minuut en decanteren buffer. Bereid de antilichamen-proteïne A/G-kralen: om het antilichaam aan de kralen te binden, voeg 300 μL IP-buffer 1 en 10 μg van het gewenste antilichaam toe. Laat het kraal/antilichaam mengsel op een nacht op een nutator op 4 °C rocken. Voor alleen kraal besturingselementen, geen antilichamen toevoegen.Opmerking: een totaal van 10 μg antilichaam per replicaat kan als uitgangspunt worden gebruikt, maar het exacte bedrag moet worden geoptimaliseerd voor elk afzonderlijk antilichaam en de schaal van het lysaat dat in het experiment wordt gebruikt. Ontdooi de nucleaire lysaten uit stap 2,10 in een waterbad en aliquot-geschikte volumes in microcentrifugebuisjes met lage retentie voor 1 mg eiwit invoer per replicaat. Draai het lysaat op 16.000 x g gedurende 30 minuten en breng het supernatant over naar een nieuwe buis. Voeg 1 μL benzonase (250 eenheden/μL) per 1 mg nucleair lysaat toe en steen op een nutator bij 4 °C gedurende 10 − 15 minuten. Bereid kralen voor Preclearing van het lysate. Voeg 12,5 μL van elk eiwit A en eiwit G kralen toe aan 1,5 mL lage retentie buizen zoals in stap 4,1. Was 2x met IP Wash buffer 1 + Pi’s en decaner de buffer. Voeg 1 mg nucleair lysaat toe aan de kralen uit stap 4,5. Inincuberen tijdens het schommelen op een nutator gedurende 1 uur bij 4 °C. Centrifugeer voorlerende lysaten bij 1.500 x g en 4 °c gedurende 1 minuut. Terwijl nucleaire lysaten in stap 4.5.1 met kralen worden geïnbeend, was de antilichaam-proteïne A/G-kralen 2x met IP-buffer 1 + Pi’s. Centrifugeer bij 1.500 x g en 4 °c gedurende 1 minuut en decaner de buffer. Breng het precleared Nuclear lysaat over van stap 4.6.1 op de antilichamen-proteïne A/G-kralen. Inbroed tijdens het schommelen op een nutator bij 4 °C gedurende 4 uur. Centrifugeer na de incubatie bij 1.500 x g en 4 °c gedurende 1 minuut. Breng het supernatant over in buizen die zijn gelabeld als de doorstroming voor elke replicaat. Was de antilichaam-proteïne A/G kralen met 1 mL IP buffer 2 + Pi’s. Centrifugeer bij 1.500 x g en 4 °c gedurende 1 minuut, decanterende buffer en herhaal dit voor een totaal van 3x. Was de parels 2x met 1 mL IP buffer 1 + Pi’s centrifugeren zoals in de vorige stap. Zorg ervoor dat alle buffer na de laatste wasbeurt wordt verwijderd. Elute 2x met 20 μL 0,1 M glycine (pH 2,75) gedurende 30 min elk. Zorg ervoor dat de buizen schommelen tijdens de incubatie met de elutie buffer. Draai bij 750 x g en 4 °c gedurende 1 minuut en Pipetteer na elke incubatie van 30 minuten het supernatant.Opmerking: terwijl de lage pH Glycine-methode hier beschreven de meeste aas eiwitten, sommige antilichaam-antigeen interacties vereisen strengere buffer voorwaarden. Flash Freeze elueert in vloeibare stikstof en bewaart bij-80 °C. 5. monstervoorbereiding Opmerking: insuline spiked in de immunoprecipitatie elutie monsters helpt bij het herstel van eiwitten tijdens Trichloorazijnzuur (TCA) neerslag en monsterverwerking, wat belangrijk is voor lage overvloed endogene Bait eiwitten. De eluaten bij kamertemperatuur ontdooien indien bevroren. Plaats de monsters op ijs en voeg 10 μL van 1,0 mg/mL insuline toe voor elke 100 μL eluaat. Vortex en voeg vervolgens onmiddellijk 10 μL 1% natrium deoxycholaat toe. Vortex het monster opnieuw en Voeg 30 μL 20% TCA toe, gevolgd door één laatste Vortex. Inbroed de monsters op ijs gedurende 20 minuten en Centrifugeer gedurende 30 minuten op 21.000 x g bij 4 °c. Zuig het supernatant op en Voeg 0,5 mL aceton toe die is voorgekoeld tot-20 °C. Vortex en draai vervolgens op 21.000 x g en 4 °c gedurende 30 min. Herhaal deze stap. Aspireren de supernatant en lucht drogen de pellet overgebleven in de bodem van de buis. Bereid het monster voor massaspectrometrie met behulp van een gemodificeerde filter aided sample prep (FASP) methode, geoptimaliseerd voor het verminderen van de verwerking van monsters, zoals hieronder beschreven14. Rebreng de proteïne pellet uit stap 5.1.4 met 30 μL SDS-alkylatie buffer (Zie tabel 1). Inbroed het monster op een warmte blok van 95 °C gedurende 5 minuten. Laat het gedurende 15 minuten afkoelen bij kamertemperatuur voordat u voorafgaat aan de volgende stap. Voeg aan elk monster 300 μL UA-oplossing en 30 μL 100 mM TCEP toe. Laad deze oplossing op een 30-k centrifugale filter. Draai het centrifugale filter op 21.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.Opmerking: het aas-eiwit en de putende interactors moeten op dit moment aan het filter worden gebonden. De stroom door kan echter worden bewaard, voor het geval er een probleem is met het filter. Was het filter met 250 μL UA en centrifugeer bij 21.000 x g gedurende 10 min. decaner de stroom doorheen en herhaal dit voor een totaal van 3x. Was het filter met 100 μL 100 mM tris pH 8,5 en centrifugeer bij 21.000 x g gedurende 10 min. decante de stroom door en herhaal dit voor een totaal van 3x. Voeg 3 μL van 1 μg/μL Lys C geresuspendeerd in 0,1 M Tris pH 8,5. Vul de filters tot aan de 100 μL markering en laat 1 uur verteren bij 37 °C tijdens het schommelen op een nutator. Voeg 1 μL van 1 μg/μL MS-graad trypsine toe. Meng zachtjes en laat de trypsine met het monster ‘s nachts bij 37 °C inbrotsen terwijl u op een nutator rockt. Centrifugeer bij 21.000 x g gedurende 20 minuten om de peptide van het filter te elzen.Opmerking: er kunnen meerdere Centrifugeer ronden nodig zijn om al het eluaat te herstellen. Als dit niet gebeurt, is er een potentieel voor ernstige monsterverlies. Ontzout de peptiden met C18 spin-kolommen. Volg het protocol dat door de fabrikant is verstrekt. Respendeer het gelyofiliseerd peptide in 7 μL van 0,1% TFA in 5% acetonitril. Sonicate het monster voor 3 min om ervoor te zorgen dat de peptiden zijn geresuspendeerd. Spin naar beneden op 14.000 x g gedurende 10 min. Breng het geresuspendeerde peptide over in een geschikte monster flacon voor het laden op het vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC/MS)-systeem. 6. LC/MS systeem geschiktheid Opmerking: vanwege de kleine schaal en over het algemeen lagere overvloed aan eiwitten uit affiniteit-gezuiverde monsters, is het essentieel dat het LC/MS-platform werkt met een maximale gevoeligheid en robuustheid. Voeg 1 mL LC/MS-klasse-mierenzuur toe aan 1 L LC/MS-kwaliteit water voor mobiele fase A en voeg 1 mL LC/MS-klasse-mierenzuur toe aan 1 L LC/MS-rang acetonitril voor mobiele fase B. Bereid of installeer een 75 μm gesmolten silica capillaire kolom verpakt met < 2 μm omgekeerde fase C18 Resin met een lengte van ≥ 250 mm. De beste resultaten zullen worden verkregen met een directe injectie van monsters in de kolom. Verwijder het Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) systeem met nieuwe mobiele fases. Met een C18-kolom geïnstalleerd, een stabiele stroomsnelheid en elektro spray met een geschikte emitter (d.w.z. 20 μm id x 360 μm od getrokken naar een 10 μm punt) vast te stellen. Houd de kolom bij 40 − 60 °C. Test de algehele LC/MS-systeemprestaties door een complexe kwaliteitscontrole standaard te injecteren, zoals 100 − 200ng van een HeLa hele cel lysaat tryptische Digest. Elueer met een geschikte gradiënt voor een complex monster (d.w.z. 2 − 3 h gradiënt elzen tijd). Stel een basislijn systeemprestaties van de peptide en eiwit identificaties.Opmerking: voor de beste resultaten zullen 3000 − 5000 of meer eiwit identificaties van 20000 − 35000 unieke peptiden optimale prestaties bieden voor experimentele monsters. Injecteer voor de routinematige LC/MS-systeem geschiktheid 100 − 200 fmol of minder van één eiwit Digest-standaard, zoals boviene serum albumine (BSA). Elute met een korte gradiënt (d.w.z. 20 − 30 min).Opmerking: Meervoudige injecties van een eiwit Digest helpen bij het vaststellen van de systeemprestaties van de LC/MS-basislijn en herhalen de injectie na elke IP-MS-sample biedt een maatstaf voor de prestaties van het systeem gedurende het experiment en maakt het mogelijk om instrument drift te detecteren, wat kan worden bepaald met label vrije experimenten. Een basislijn van de Selecteer individuele piek intensiteiten en piek vormen zal informeren over MS, LC en kolom prestaties. Om overbelasting van de analytische kolom te voorkomen, laadt u een klein deel (15 − 30% van het totaal) van een experimenteel monster op de kolom en scheidt u het met een gradiënt die geschikt is voor complexe monsters (d.w.z. 2 − 3 uur). Als het aantal eiwit identificaties niet bevredigend is, laadt u het hele monster op de kolom. Voer een standaard met één eiwit samenvatting uit tussen de voorbeelden om de LC/MS-systeemprestaties te bewaken en het karryover te samplen. Er kunnen meerdere normen nodig zijn om de monster overdracht te verminderen, afhankelijk van uw monsters. 7. gegevensverwerking Download het proteomica softwarepakket maxquant gevonden op https://www.maxquant.org/.Opmerking: dit wordt gebruikt voor het verwerken van het ONBEWERKTE MS-gegevensbestand van stap 6,6 in gegevenstabellen van eiwit-Id’s, gennamen en kwantitatieve waarden die zijn gekoppeld aan de identificatie van deze voor downstream-analyse. Selecteer laden in de subkop invoergegevens van het tabblad onbewerkte gegevens . Open de bestandslocatie waar de MS RAW-bestanden worden opgeslagen en selecteer RAW-bestanden voor elke MS/MS-uitvoering. Klik op het groepsspecifieke tabblad en selecteer spijsvertering. Selecteer in de enzym lijst Lysc en klik op de pijl naar rechts om dit enzym toe te voegen aan de lijst die zal worden gebruikt in de zoekopdracht. Selecteer vervolgens instrument en zorg ervoor dat het juiste instrument type wordt weergegeven in de vervolgkeuzelijst boven aan het scherm. Laat andere groepsspecifieke zoekparameters op standaardinstellingen staan. Klik op het tabblad algemene parameters en selecteer reeksen. Voeg het juiste FASTA-bestand toe voor de taxonomie die in deze zoekopdracht wordt gebruikt. Peptiden zullen niet goed worden toegewezen als dit niet wordt gedaan. Download voor het menselijke Proteoom het FASTA-bestand van UniProt op https://www.uniprot.org/help/human_proteome. Klik binnen het tabblad algemene parameters op eiwit kwantificering. Selecteer in het vervolgkeuzemenu peptiden voor kwantificering de optie uniek + scheerapparaat.Opmerking: MaxQuant biedt alternatieve kwantificering van eiwitten door middel van op intensiteit gebaseerde absolute kwantificatie (iBAQ) en labelvrije quantitatie (LFQ). Peptide Count informatie is echter voldoende voor de downstream-analyse in dit protocol15. Selecteer linksonder in de interface MaxQuant het aantal processors dat voor de zoekactie moet worden gebruikt. Dit heeft direct invloed op de tijdsduur die nodig is voor de uitvoering, dus Selecteer zo veel mogelijk voor dit). Klik op Start linksonder in het scherm om de uitvoering te starten. Selecteer het tabblad prestaties boven aan het scherm om de voortgang van de zoekopdracht weer te geven. Wanneer de uitvoering is voltooid, opent u het bestand proteingroups. txt in Perseus, een proteomica-berekenings platform of een ander spreadsheetprogramma om de gegevens16te bekijken. Gebruik Perseus om veelvoorkomende verontreinigingen en hits te verwijderen naar omgekeerde eiwit sequenties. Volg de gedetailleerde Perseus-documentatie op http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:use_cases:interactions.Opmerking: als u het bestand proteingroups. txt opent in analyse software (bijvoorbeeld Excel), worden bepaalde namen van genen en eiwitten automatisch beschadigd. Analyseer experimentele gegevens met behulp van de contaminant-opslagplaats voor Affiniteits zuivering (CRAPome). Registreer een account bij deze repository http://crapome.org/en volg de tutorial zo nodig17,18. Gebruik de analyseren van uw gegevens werkstroom gevonden op de CRAPome homepage. Selecteer externe besturingselementen die corresponderen met het affiniteits zuiveringssysteem dat in dit interactie experiment wordt gebruikt.Opmerking: deze besturingselementen kunnen worden gebruikt voor het berekenen van een tweede vouw verandering verrijking die nuttig is voor het opsporen van algemene verontreinigingen. Genereer een invoerbestand uit de uitvoer van de proteingroups. txt van MaxQuant met behulp van Perseus of een geschikte spreadsheet applicatie. Details voorhand matige opmaak u vinden op http://crapome.org/?q=fileformatting. U ook het opgegeven R-script export_CRAPomeSAINT_Input_File. R gebruiken om het invoerbestand van SAINT/CRAPome te genereren. Zie README. txt in de aanvullende coderings bestanden. Een analyse uitvoeren om te bepalen van de fold-Change verrijking en SAINT (significantie analyse van INTeractome) waarschijnlijkheid voor elk aas eiwit in de immunoprecipitatie. Zorg ervoor dat ‘ gebruiker besturingselementen’ is geselecteerd in het vervolgkeuzemenu onder FC-A, ‘ crapome Controls ‘ of ‘ alle besturingselementen ‘ zijn geselecteerd in de FC-B vervolgkeuzelijst en waarschijnlijkheids Score is geselecteerd voor het genereren van de kansen van de Heilige. Wanneer de uitvoering is voltooid, weergeven van de uitvoer die beschikbaar is onder ‘ analyseresultaten ‘ samen met een taak-id. Download de data matrix uit de ‘ analyseresultaten ‘ voor toekomstige plotten en data visualisatie. Plot eiwitten als een functie van FC-A (IPs vs. gebruikers controles) en SAINT waarschijnlijkheid door het volgen van de R-scripts zoals voorzien in aanvullende codering bestanden.Opmerking: een reeks R-scripts is bedoeld voor het produceren van plots van FC-A versus SAINT-waarschijnlijkheid en iBAQ vs. log2 (eiwit overvloed), gekleurd door het aangepaste p-waarde bereik van empirische Bayes-analyse van de label vrije intensiteiten. De details van de differentiële statistische analyse en plotten zijn te vinden in README. txt en het R-script “main_differential_analysis. R “in de aanvullende coderings bestanden. Evalueer waar bekende interacties eiwitten van het aas eiwit worden gerangschikt door FC-A en SAINT. Maak een cutoff van FC-a > 3,00 en Saint > 0,7 voor single Bait experimenten in drievoud als uitgangspunt.Opmerking: selectie van afgeknipte voor een “hoog-vertrouwen” interactie en een “weinig vertrouwen” interactie moet worden geïnformeerd door biologische informatie. 8. data visualisatie Opmerking: er zijn veel Programma’s die de gegevens van proteomica (bijv. R, Perseus, cytoscape, String-DB) effectief kunnen visualiseren. Het analyseren van de connectiviteit tussen high-Confidence hits en functionele verrijking van deze interactoren kan een bruikbare strategie zijn voor het prioriteren van hits voor verdere validatie en functionele karakterisering. Download Cytoscape, een open source Network visualisatietool op https://cytoscape.org/download.html19. Bereid een invoerbestand voor interactiegegevens voor als een door tabs gescheiden bestand dat is opgemaakt met drie kolommen: aas (bronknooppunt), prooi (doelknooppunt), type interactie (randtype). Dit kan gedaan worden in Perseus of een spreadsheetprogramma naar keuze. Selecteer de Importeer tabel van het bestands pictogram naar de linkerbovenhoek van het programma (aangeduid met een neerwaartse pijl en een matrix in het pictogram). Cytoscape zal de interactiegegevens automatisch invullen in een netwerk dat klaar is voor aangepaste opmaak en ontwerp. Selecteer het tabblad stijl in het Configuratiescherm voor Cytoscape en klik op de vierkantjes in de kolom def om het kenmerk voor het hele netwerk aan te passen. Selecteer specifieke knooppunten of randen in het netwerk en selecteer vervolgens het vierkant in de kolom Byp. van het menu stijl om de standaardinstellingen te omzeilen en alleen geselecteerde objecten aan te passen. U ook op het dropdownmenu boven aan het menu stijl klikken om de vooraf ingestelde netwerk indelingen weer te geven.Opmerking: tekenreeks-DB eiwit-eiwit interactiegegevens kunnen worden geïntegreerd in dit netwerk op dit moment hetzij handmatig via het invoerbestand of via verschillende verrijkings middelen beschikbaar als plug-ins in Cytoscape, http://apps.cytoscape.org/20. Een aanbevolen cytoscape plug-in voor verrijkings analyse is te vinden op http://apps.cytoscape.org/apps/cluego21. Om het vertrouwen te vergroten in de gegevensset die in deze workflow wordt gegenereerd, voert u wederzijdse IP-MS of IP-westerse experimenten uit die gericht zijn op prooi eiwitten die van belang zijn als aas.