Без этикетки Иммунопрецитис Масса Спектромтертрия Рабочий процесс для крупномасштабного ядерного взаимодействия Профилирование

ПРИМЕЧАНИЕ: Все буферные композиции и смеси протеазы изложены в таблице 1. 1. Подготовка клеток ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого подхода иммунопрецитистной масс-спектрометрии (IP-MS) желательно исходный материал в размере 1,10 мг ядерного лисата на реплику. Количество клеток будет уделяться 1 мг ядерных иммунопрециаций в тройной плюс тройной контроль. При использовании линии клеток адепта, вырастите клетки до 90% в 3 х 15 см блюд на реплику до сбора урожая.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется выполнять как минимум три репликации иммунопреципций для приманки и условий контроля. Этот протокол будет предполагать использование “только бисера” элементы управления, которые контролируют для обильных неспецифических взаимодействий с бисером, начиная с раздела 4. Другие типы элементов управления могут быть полезны. Они подробно описаны в разделе обсуждения. Вымойте пластины 2x с фосфатами буферного сольника (PBS) и trypsinize клеток с помощью 3 мл 0,25% трипсина на 15 см пластины. Спин вниз клетки на 1200 х г в течение 5 мин и decant трипсин. Для подвесных клеток, расти до аналогичной шкалы / плотности для достижения 70-80 мг общего белка. Клетки пеллет при 1200 х г и 4 кв. м в течение 5 мин. Декантированные средства массовой информации тщательно.ПРИМЕЧАНИЕ: Пеллеты могут быть объединены во время этого шага, чтобы обеспечить эффективную обработку с использованием крупномасштабной субклеточной фракционации, изложенной в разделе 2. Вымойте клеточные гранулы 2x с PBS 5 мМ MgCl2 дополнены ингибиторами протеазы (ИП) и ингибиторами фосфатазы (PhIs) (см. Таблица 1).ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные гранулы могут быть заморожены в жидком азоте и храниться при -80 градусов по Цельсию до готовности к фракционации. 2. Подготовка ядерного экстракта ПРИМЕЧАНИЕ: Ингибиторы протеазы и фосфатазы должны быть добавлены к буферам фракционирования в течение 30 минут использования. Если заморожены, разморозить клеточные гранулы в течение 15 минут в 1x пеллет объем холодного буфера A и ИП / PhIs. Поместите клетку гранулы на nutator на 4 кВ, чтобы помочь в повторной подвески при оттаивании. В противном случае, resuspend клетки гранулы от шага 1.3 в 1x объем гранул Буфер A и PIs /PhIs. Пеллетка на 2000 х г и 4 кв кв 10 мин. Декант буфер. Приостановить клетки с 5x упакованы объем клеток с буфером А и инкубировать на льду в течение 20 минут. Пеллетка на 2000 х г и 4 кс в течение 10 мин. Декант буфера и resuspend с 2x оригинальный объем упакованных клеток Buffer A и PIs / PhIs и dounce 7x с “A”/loose пестль. Центрифуге лизат в течение 10 мин при 2000 х г и 4 кв. C. Тщательно pipette от супернатанта и флэш заморозить с жидким азотом. Храните лизат при -80 градусах Цельсия. Супернатантом от этого шага является цитосоличная субклеточная фракция.ПРИМЕЧАНИЕ: Ядерные гранулы могут быть сохранены во время этого шага путем флэш-замораживания с жидким азотом и хранения при -80 градусах Цельсия Приостановите гранулы с 0,9-дюймовым объемом гранул буфера B и PIs/ PhIs и смешайте на nutator в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. Чтобы линзить ядра, выбросить 20x с более жесткой пестик “B”. Смешайте ядерный лисат на nutator в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия, чтобы он был однородным. Центрифуга ядерный лисат в течение 30 мин при 21000 х г при 4 градусах Цельсия. Pipette от supernatant и сохранить как растворимый ядерный экстракт белка.ПРИМЕЧАНИЕ: Nuclease лечение в результате ядерных гранул позволяет для восстановления хроматин связанных белковой фракции. Диализ растворимый ядерный экстракт против Буфер C и ИП в течение 3 ч при 4 градусах Цельсия. Вырежьте соответствующую длину 24 мм шириной диализа трубки с 8 kDa молекулярного веса отрезали. Зажимая одну сторону трубки и загрузите нуклеоплазму в трубку. После загрузки лизата, зажим другой конец и погрузиться в чистый стеклянный контейнер, содержащий Buffer C и ИП. Центрифуги диализированный ядерный экстракт / нуклеоплазма при 21000 х г при 4 градусах по Цельсию в течение 30 мин. Aliquot 3x 20 л объемов ядерного экстракта для фракционирования проверки западной помок. Ядерный экстракт, используемый для анализа IP-MS, может быть алицитирован и флэш-заморожен в жидком азоте и при необходимости храниться при -80 градусах Цельсия. 3. Проверка субклеточной фракционности Провести протеиновый анализ для определения концентрации белка ядерного лизата. Анализ белка bicinchoninic кислоты обеспечивает достаточную чувствительность для применения вниз по течению. Нагрузка 20 мкг как цитосолильных и ядерных фракций на SDS-PAGE гель для западного анализа подьение, как ранее описано13. Пропустить полосы движения при загрузке, чтобы избежать неправильной характеристики образца. Зонд западной помарка для p84 (THOC1) в качестве ядерного маркера, и GAPDH как цитосолик маркер. Определить степень фракции по соотношению цитосоликического маркера в ядерной фракции и наоборот.ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела для других ядерных и цитосоликовых маркеров могут быть использованы. 4. Иммунопрециция эндогенного белка ядерной приманки ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать трубки с низким уровнем удержания с этого момента. Это позволит уменьшить неспецифическую привязку к трубам во время обработки образцов и избежать ненужной потери образца. Кроме того, убедитесь, что LCMS класса H2O используется для подготовки буферов для остальных шагов. Приготовьте смесь бисера из белка A/G для каждой репликации, объединив 12,5 л объема бисера как для белка-А, так и для белка-G в микроцентрифуговых трубках. Храните запасы биса в виде суспензии, содержащей 20% этанола. Определите концентрацию бусин в суспензии %(v/v) и pipette необходимый том с помощью наконечника пипетки, которая была вырезана на кончике, чтобы гарантировать, что бусы могут войти в кончик. Вымойте белок A/ G бисовой смесь 2x с 300 зл ис. Спин бисерна на 1500 х г при 4 c в течение 1 мин и декант буфера. Приготовьте антитела-белок A/G шарики: Чтобы связать антитело с бисером, добавьте 300 зл ис. Разрешить смесь бис/антитела, чтобы покачать на nutator на 4 кв. C в одночасье. Для бис-только контроля, не добавляйте антитела.ПРИМЕЧАНИЕ: В общей сложности 10 мкг антител на реплику может быть использован в качестве отправной точки, но точное количество должно быть оптимизировано для каждого отдельного антитела и масштаба лизата, используемого в эксперименте Оттепель ядерных лисатов от шага 2.10 в водяной бане и aliquot соответствующие объемы в низкой удержания микроцентрифуговых труб для 1 мг белка ввода на реплику. Спин лизат на 16000 х г в течение 30 минут и передать супернатант в новую трубку. Добавьте 1 кЛ бензоназы (250 единиц/Л) на 1 мг ядерного лисата и покачали на nutator при 4 градусах по Цельсию в течение 10-15 мин. Подготовка бисера для предварительного очистки лизата. Добавьте 12,5 л каждого белка А и белковых бусин G в 1,5 мл низкоудерживающие трубки, как и в шаге 4.1. Вымойте 2x с IP Wash Buffer 1 и ИП и decant буфера. Добавьте 1 мг ядерного лисата к бисеру со ступени 4.5. Инкубировать во время раскачивания на nutator для 1 ч при 4 градусах Цельсия. Центрифуга предварительно расчищена лизатами на 1500 х г и 4 кв кв 1 мин. В то время как ядерные лисаты инкубируются бисером в шаге 4.5.1, промойте антитело-белок A/G бусы 2x с IP-буфером 1 и ИП. Центрифуга при 1500 х г и 4 кв. м в течение 1 мин и декантбуфер. Перенесите предварительно очищенный ядерный лисат со шага 4.6.1 на бусы антитела-белки A/G. Инкубировать во время раскачивания на nutator при 4 c для 4 h. Центрифуга после инкубации на 1500 x g и 4 c для 1 мин. Передача супернатанта в трубки помечены как поток через для каждого репликации. Вымойте антитела-белок A/G шарики с 1 мл IP буфера 2 и ИП. Центрифуга при 1500 х г и 4 кв. м на 1 мин, декант буфер, и повторить в общей сложности 3x. Вымойте бисер 2x с 1 мл IP буфера 1 “PIs центрифуги, как и в предыдущем шаге. Убедитесь, что весь буфер удаляется после последней стирки. Elute 2x с 20 л 0,1 М глицин (pH 2.75) для 30 мин каждый. Убедитесь, что трубы качается во время инкубации с elution буфера. Спин на 750 х г и 4 кв в течение 1 мин и пипетка от супернатанта после каждого 30 минут инкубации.ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как метод низкого рН глицин, описанный здесь, выясняет большинство белков приманки, некоторые антитела-антигенные взаимодействия требуют более строгих условий буфера. Вспышка замерзает в жидком азоте и хранится при -80 градусах Цельсия. 5. Подготовка образцов ПРИМЕЧАНИЕ: Инсулин шипами в иммунопреционно-элютиционных образцов помогает в восстановлении белков во время трихлороацетической кислоты (TCA) осадков и обработки образцов, что важно для низкого изобилия эндогенных белков приманки. Оттепель eluates при комнатной температуре, если замороженные. Поместите образцы на лед и добавьте 10 л инсулина по 1,0 мг/мл на каждые 100 л элюат. Вихрь, а затем сразу же добавить 10 Зл 1% дезоксихолата натрия. Vortex образца снова и добавить 30 л 20% TCA следуют один окончательный вихрь. Инкубировать образцы на льду в течение 20 мин, затем центрифуги при 21000 х г при 4 градусах по Цельсию в течение 30 мин. Аспирировать супернатант и добавить 0,5 мл ацетона, который был прехоперирован до -20 градусов по Цельсию. Vortex, а затем спина на 21000 х г и 4 кв к в течение 30 мин. Повторите этот шаг. Аспирируйте супернатант и просушите гранулы, оставшиеся в нижней части трубки. Подготовьте образец для масс-спектрометрии с помощью модифицированного метода Filter Aided Sample Prep (FASP), оптимизированного для уменьшения обработки образцов, как указано ниже14. Приостановить протеиновые гранулы со ступени 5.1.4 с 30 Зл SDS Алкилационный буфер (см. Таблица 1). Инкубируйте образец на теплоблоке 95 градусов по Цельсию в течение 5 мин. Дайте ему остыть при комнатной температуре в течение 15 минут до начала следующего шага. Добавьте 300 юаней раствора UA и 30 юл tCEP 100 мм к каждому образцу. Загрузите это решение на 30k центробежный фильтр. Закрутите центробежный фильтр при температуре 21 000 х г при комнатной температуре в течение 10 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Белок приманки и его ориентировочных интерактеров должны быть привязаны к фильтру в этой точке. Тем не менее, поток через может быть сохранен, в случае, если есть проблемы с фильтром. Вымойте фильтр с 250 л UA и центрифуги на 21000 х г в течение 10 мин. Декант потока через и повторить в общей сложности 3x. Вымойте фильтр с 100 мл 100 мм Tris pH 8,5 и центрифуги на 21000 х г в течение 10 мин. Декант поток через и повторить в общей сложности 3x. Добавьте 3 зЛ из 1 мкг/Л Lys C, вновь взвешенных по цельсию 0,1 м tris pH 8.5. Заполните фильтры до отметки 100 л и дайте переварить в течение 1 ч при 37 градусах Цельсия, пока качаясь на nutator. Добавьте 1 кЛ 1 мкг/ трипсин класса МС. Смешайте осторожно и дайте трипсину инкубировать с образцом на ночь при 37 градусах Цельсия, пока качаясь на nutator. Центрифуге при 21 000 х г в течение 20 мин, чтобы вывести пептид из фильтра.ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько раундов центрифугирования может потребоваться, чтобы восстановить все eluate. Если этого не сделать, существует вероятность серьезной потери образца. Обезсоль пептиды с помощью C18 спиновые столбцы. Следуйте протоколу, предоставленному производителем. Приостановите лиофилизированный пептид в 7 зЛ 0,1% TFA в 5% ацетонитрила. Снопсите образец в течение 3 минут, чтобы убедиться, что пептиды были повторно приостановлены. Спин вниз на 14000 х г в течение 10 мин. Перенесите переплетив пептид в соответствующий образец флакона для загрузки на систему жидкой хроматографии-масс-спектрометрии (LC/MS). 6. Пригодность системы LC/MS ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за небольшого масштаба и, как правило, более низкого изобилия белка из сродничества очищенных образцов, очень важно, чтобы платформа LC/MS работала с максимальной чувствительностью и надежностью. Добавьте 1 мл для LC/MS класса formic кислоты к 1 l воды класса LC/MS для мобильной фазы А и добавьте 1 мл для LC/MS класса formic кислоты к 1 l ацетонитрила класса LC/MS для мобильной фазы B. Подготовьте или установите 75 мкм сливки капиллярной колонки упакованы с lt;2 мкм обратной фазы C18 мизины, что составляет 250 мм в длину. Наилучшие результаты будут достигнуты при прямом впрыске образцов в колонку. Очистка системы Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) со свежими передвижными фазами. С установленной колонкой C18 установите стабильную скорость потока и электроспрей с подходящим излучателем (т.е. 20 мкм ID x 360 мкм od вытащил на кончик е 10 мкм). Поддерживайте столбец на уровне 40–60 градусов по Цельсию. Проверьте общую производительность системы LC/MS, внедрив комплексный стандарт контроля качества, например 100-200нг в тризатном тризатном тризате HeLa. Elute с подходящим градиентом для сложного образца (т.е. 2’3 h градиента время выброса). Установить базовую систему идентификации пептида и белка.ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов, 3000-5000 или более идентификации белка из 20 000-35 000 уникальных пептидов обеспечат оптимальную производительность для экспериментальных образцов. Для обычной пригодности системы LC/MS вводят 100–200 моль или менее одного стандарта дайджеста белка, например, Сыворотка для крупного рогатого скота (BSA). Выдолбсите с коротким градиентом (т.е. 20–30 мин).ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько инъекций белкового дайджеста помогут установить базовую производительность системы LC/MS, а повторные инъекции после каждого образца IP-MS обеспечивают меру производительности системы на протяжении всего эксперимента и позволяют обнаружить дрейф прибора, который может предусматривать эксперименты без этике. Базовая линия отдельных пиковых интенсивностей и пиковых форм будет информировать о производительности MS, LC и столбца. Чтобы избежать перегрузки аналитической колонки, загрузите небольшую часть (15–30% от общего объема) экспериментального образца на столбец и разделите с помощью градита, пригодного для сложных образцов (т.е. 2–3 ч). Если количество идентификационных данных белка является неудовлетворительным, загрузите весь образец на столбец. Выполнить единый стандарт переваривания белка между образцами для мониторинга производительности системы LC/MS и переноса образцов. Для уменьшения переноса образцов может потребоваться несколько стандартов в зависимости от образцов. 7. Обработка данных Скачать proteomics пакет программного обеспечения Maxquant найти в https://www.maxquant.org/.ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет использоваться для обработки файла данных RAW MS от шага 6.6 в таблицы данных идентиверенных белков, имен генов и количественных значений, связанных с их идентификацией для анализа ниже по течению. Выберите загрузку в подзаголовке данных ввода холостого вкладки Raw Data. Откройте местоположение файла, где хранятся необработанные файлы MS, и выберите необработанные файлы для каждого запуска MS/MS. Нажмите на вкладку Group-Specific и выберите Digestion. В списке ферментов выберите LysC и нажмите на правую стрелку, чтобы добавить этот фермент в список, который будет использоваться в поиске. Затем выберите инструмент и убедитесь, что правильный тип инструмента отображается в списке выпадающих вниз в верхней части экрана. Оставьте другие параметры поиска, специфичные для конкретной группы, на стандартных настройках. Нажмите на вкладку «Глобальные параметры» и выберите последовательности. Добавьте соответствующий файл FASTA для таксономии, который будет использоваться в этом поиске. Пептиды не будут назначены должным образом, если это не будет сделано. Для протеома человека, скачать файл FASTA от UniProt в https://www.uniprot.org/help/human_proteome. В рамках вкладки Global Parameters нажмите на количественификацию белка. В пептидах для количественного выпадения меню, выберите Уникальный й Razor.ПРИМЕЧАНИЕ: Max Quant предлагает альтернативную количественную оценку белков через абсолютную количественную оценку на основе интенсивности (iBA) и квантитацию без этике (Lf). Тем не менее, информация о количестве пептидов достаточна для анализа вниз по течению в этом протоколе15. В левом нижнем углу интерфейса Max’uant выберите количество процессоров, которые будут использоваться для поиска. Это напрямую повлияет на время, необходимое для выполнения, поэтому выберите как можно больше для этого. Нажмите “Старт” в левом нижнем углу экрана, чтобы запустить запуск. Выберите вкладку «Производительность» в верхней части экрана для просмотра хода поиска. Когда запуск завершен, откройте файл proteingroups.txt в Perseus, платформе вычислений протеомики или другой программе таблицы для просмотра данных16. Используйте Perseus для удаления общих загрязняющих веществ и хитов вспять белковых последовательностей. Следите за подробной документацией Персея в http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:use_cases:interactions.ПРИМЕЧАНИЕ: Открытие файла proteingroups.txt в программном обеспечении анализа (например, Excel) автоматически повредит определенные имена генов и белков. Анализ экспериментальных данных с помощью хранилища загрязняющих средств для очистки сродства (CRAPome). Зарегистрируйте учетную запись в этом репозитории http://crapome.org/ и следуйте учебнику по мере необходимости17,18. Используйте рабочий процесс «Анализ данных», найденный на главной странице CRAPome. Выберите внешние элементы управления, которые соответствуют системе очистки сродства, используемой в этом эксперименте взаимодействия.ПРИМЕЧАНИЕ: Эти элементы управления могут быть использованы для расчета обогащения изменения второго раза, что полезно для обнаружения общих загрязняющих веществ. Создайте входный файл из протеиновых групп.txt выход из Maxquant с помощью Perseus или подходящего приложения таблицы. Подробную информацию о ручном форматировании можно найти на http://crapome.org/?q=fileformatting. Кроме того, используйте предоставленный R-скрипт “export_CRAPomeSAINT_Input_File.R” для генерации вхотого файла SAINT/CRAPome. Смотрите README.txt в дополнительных файлах кодирования. Выполнить анализ, чтобы определить сложенное изменение обогащения и SAINT (Значение Анализ INTeractome) вероятность для каждого белка приманки в иммунопротеципиента. Убедитесь, что ‘User Controls’выбран в выпадающем меню под FC-A, ‘CRAPome управления’ или ‘Все элементы управления’ выбраны в FC-B выпадения вниз и вероятность Оценка выбран для создания вероятности SAINT. По завершении выполнения просмотрите вывод, доступный в “Результаты анализа”, а также идентификатор задания. Скачать матрицу данных из “Результаты анализа” для будущего построения и визуализации данных. Участок белков в качестве функции FC-A (IPs против управления пользователями) и SAINT вероятность, следуя R-Скрипты, как это предусмотрено в дополнительных файлов кодирования.ПРИМЕЧАНИЕ: Набор R скриптов предоставляется для производства участков FC-A против SAINT вероятности и iBA’ против журнала2 (белковое изобилие), окрашенных скорректированный диапазон значения р от эмпирического анализа Bayes без этикетки интенсивности. Подробная информация о дифференциальном статистическом анализе и построении данных содержится в README.txt и R script “main_differential_analysis. R” в дополнительных файлах кодирования. Оцените, где известные взаимодействующие белки белка приманки ранжируются FC-A и SAINT. Сделать отсечение FC-A йgt; 3,00 и SAINT йgt; 0,7 для одной приманки экспериментов в тройной в качестве отправной точки.ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор отсечений для “высокой уверенности” взаимодействующих и “низкой уверенности” взаимодействующих должны быть проинформированы биологической информации. 8. Визуализация данных ПРИМЕЧАНИЕ: Есть много программ, которые могут эффективно визуализировать данные протеомики (например, R, Персея, Cytoscape, STRING-DB). Анализ связи между хитами с высокой степенью достоверности и функциональное обогащение этих взаимодействующих может быть полезной стратегией для определения приоритетов хитов для дальнейшей проверки и функциональной характеристики. Скачать Cytoscape, инструмент визуализации сети с открытым исходным кодом в https://cytoscape.org/download.html19. Подготовьте файл ввода для данных взаимодействия в виде файла,делимитированного вкладки, отформатированного тремя столбцовами: приманка (источник), добыча (целевой узло), тип взаимодействия (тип края). Это можно сделать в Perseus или любой программе электронной таблицы по вашему выбору. Выберите таблицу импорта от значка файла к верхнему левому левому результату программы (обозначенный стрелкой вниз и матрицей в значке). Cytoscape будет автоматически заселять данные о взаимодействии в сеть, готовую к пользовательскому форматированию и дизайну. Выберите вкладку «Стиль» на панели управления для Cytoscape и нажмите на квадраты в столбце Def, чтобы настроить атрибут для всей сети. Выберите определенные узлы или края в сети, а затем выберите квадрат в столбце Byp. меню стиля, чтобы обойти настройки по умолчанию и настроить только выбранные объекты. Кроме того, нажмите на выпадающее меню в верхней части меню стиля, чтобы просмотреть предустановленные сетевые форматы.ПРИМЕЧАНИЕ: STRING-db белка белка взаимодействия данные могут быть интегрированы в эту сеть в это время либо вручную через файл ввода или через различные инструменты обогащения доступны в качестве плагинов в Cytoscape, http://apps.cytoscape.org/20. Рекомендуемый плагин cytoscape для анализа обогащения находится вhttp://apps.cytoscape.org/apps/cluego 21. Чтобы повысить достоверность данных, генерируемых в этом рабочем процессе, выполняйте взаимные IP-MS или IP-западные эксперименты, которые нацелены на интересующие добычу белки в качестве приманки.