記載されているプロテオミクスワークフローは、目的とするタンパク質の免疫親和性濃縮と標識フリー質量分析法を用いて核細胞内分画からタンパク質相互作用パートナーを同定するためのプロテオミクスワークフローである。このワークフローには、細胞内分画、免疫沈降、フィルター支援サンプル調製、オフラインクリーンアップ、質量分析、下流バイオインフォマティクスパイプラインが含まれます。
免疫親和性精製質量分析法(IP-MS)は、タンパク質間相互作用を同定する堅牢な定量方法として浮上している。本書は、他の細胞内コンパートメントにも適用できる核からの低存在量タンパク質間相互作用を同定するために設計された完全な相互作用プロテオミクスワークフローを提示する。このワークフローには、細胞内分画、免疫沈降、サンプル調製、オフラインクリーンアップ、シングルショットラベルフリー質量分析、下流の計算およびデータ可視化が含まれます。当社のプロトコルは、内因性タンパク質の免疫沈降によって、全細胞のリザース(例えば、核内の転写因子相互作用)から識別することが困難なコンパートメント化された低存在量相互作用を検出するために最適化されています。分画された細胞下コンパートメント。ここで概説するサンプル調製パイプラインは、HeLa細胞核抽出物の調製、内因性ベイトタンパク質の免疫親和性精製、定量的質量分析に関する詳細な指示を提供する。また、質量分析ベースの相互作用プロファイリング実験で大規模な免疫沈降を行う方法論的考慮事項について議論し、真陽性タンパク質を区別するためのデータ品質を評価するためのガイドラインを提供する。非特異的相互作用からの相互作用。このアプローチは、CMGCキナーゼの核相互作用体を調べるため、核内の相互作用が不十分に定義された低存在量のタンパク質キナーゼであるDYRK1Aを調べる。
ヒトプロテオームは、安定したマルチサブユニット複合体および一過性タンパク質間相互作用の形成を通じて、広大な構造的および生化学的多様性を示す。したがって、目的のタンパク質の相互作用パートナーの同定は、分子機構を解明するための調査において一般的に必要とされる。アフィニティー精製プロトコルの最近の進歩と高分解能高速走査質量分析装置の出現により、単一の偏りのない実験でタンパク質相互作用の風景を容易にマッピングできるようになっています。
タンパク質相互作用プロトコルは、一般に、アフィニティータグ付き融合構築物を有する異所性発現系を採用し、目的のタンパク質を認識する高品質の抗体を必要とせずにタンパク質相互作用を同定する。ただし、エピトープタグベースの方法にはいくつかの欠点があります。エピトープとの物理的相互作用は、非特異的コプリン化タンパク質3の検出につながる可能性がある。さらに、タンパク質のN−またはC末端へのこれらのエピトープタグの融合は、天然タンパク質間相互作用を遮断し、または非生理学的立体構造を促進するためにタンパク質の折り畳みを破壊し得る。さらに、エクトピック発現系は、典型的には、超生理学的濃度で餌タンパク質を過剰発現し、特に投与量感受性遺伝子5に対する関節実性タンパク質相互作用の同定をもたらし得る。これらの問題を回避するために、内因性餌タンパク質は、天然タンパク質を認識する高品質の抗体の入手可能性を仮定して、関連する相互作用獲物タンパク質と共に免疫沈降することができる。
ここでは、CMGCプロテインキナーゼDYRK1Aを例に用いて内因性タンパク質の核相互作用体を検出するための相互作用プロテオミクスワークフローを提供する。DYRK1Aコピー数、活性レベル、または発現の破壊は、ヒトにおいて重度の知的障害を引き起こす可能性があり、マウス6、7、8、9における胚致死性を引き起こす可能性がある。DYRK1Aは、動的時空間調節10、および区画化タンパク質相互作用11、12を示し、異なる細胞内コンパートメントに特異的な低存在性相互作用パートナーを検出することができるアプローチを必要とする。
このプロトコルは、ヒトHeLa細胞の細胞画分を細胞質および核視分画に用い、免疫沈降、質量分析のためのサンプル調製、およびデータ品質を評価し、結果を可視化するためのバイオインフォマティクスパイプラインの概要を、分析および可視化のために提供されるRスクリプトを用いる( 図1)。このワークフローで使用されるProteomicsソフトウェアパッケージは、すべて自由にダウンロード可能であるか、Webインターフェイスを介してアクセスすることができます。ソフトウェアと計算方法の詳細については、提供されているリンクの詳細なチュートリアルと指示を参照してください。
ここで概説するプロテオミクスワークフローは、目的のタンパク質に対する高信頼タンパク質インターアクターを同定するための効果的な方法を提供します。このアプローチは、細胞内分数を通じてサンプルの複雑さを軽減し、堅牢なサンプル調製、オフラインサンプルのクリーンアップ、LC-MSシステムの厳格な品質管理を通じて、識別相互作用パートナーを増やすことに焦点を当てています。ここで説明する下流データ分析は、餌と共に凝固として同定されたタンパク質の簡単な統計的評価を可能にする。しかし、実験変数の数が多いため(スケール、細胞株、抗体の選択)、各実験では、データの可視化と濃縮に関する異なるカットオフと考慮事項が必要です。
IP-MS実験における最初の設計上の考慮事項は、相互作用するパートナーと共に目的のタンパク質の凝化に使用される抗体の選択である。市販の抗体の入手可能性は、過去数十年にわたってヒトプロテオームのより大きな部分をカバーするように拡大しましたが、試薬が制限されているタンパク質はまだ多くあります。さらに、ウェスタンブロット検出などの用途について検証された抗体は、免疫沈降実験において標的タンパク質の選択的濃縮が不可能な場合がある。大規模な相互作用プロテオミクス実験を行う前に、90%コンフルエント10cm皿、または同等の細胞数からIPを完了し、ウェスタンブロッティングによって目的の標的タンパク質をプローブすることが示唆される。免疫沈降のために複数の抗体が利用可能な場合は、さらに、タンパク質の異なる部分内のエピトープを認識する複数の抗体を選択することが示唆される。ベイトタンパク質への抗体の結合は、推定相互作用パートナーに必要な結合界面を閉塞させることができる。ベイトタンパク質の二次エピトープを選択すると、質量分析ベースの実験によって同定された相互作用プロファイルのカバレッジが増加します。
第二の主要な考慮事項は、高信頼度の相互作用と低信頼または非特異的相互作用を区別するための適切な制御の選択と、餌と共に凝固していると識別されるものとの間にある。IP-MS実験のための最も厳しい制御は、餌のCRISPR KO細胞株からの免疫沈降を完了することです。このような制御は、餌タンパク質ではなく抗体に直接結合する非特異的タンパク質の同定と除外を可能にする。各ベイトタンパク質のCRISPR KO細胞株を生成することが不可能な場合には、餌抗体の同一アイソタイプのIgGビーズコントロールを使用することができます。複数の種を表す抗体のパネルを用いた実験では、ビーズのみのコントロールの使用は適切ですが、高信頼インターアクターとして同定された偽陽性の速度を増加させます。
IP-MS実験で使用される細胞株の選択は、いくつかの重要な要因に依存する。タンパク質発現および局在化は、細胞の種類に大きく依存する。RNA発現の推定値は、多くの一般的に使用される細胞株のほとんどの遺伝子に対して見つけることができるが、タンパク質発現はRNA発現との相関が悪く、実験的に25を決定しなければならない。ベイトタンパク質が非常に低いコピー数で発現する細胞株は、必要とされる可能性のある細胞培養スケールの急激な増加に関連する問題を回避すべきである。ただし、サンプル調製は、非常に低い存在量タンパク質の検出に最適化できることに留意すべきである。フィルターエイドサンプル準備(FASP)法は、堅牢でありながら、試料中のペプチドの50%以上の損失を引き起こす可能性がある。シングルポット固相増強サンプル調製(SP3)は、サンプル損失26を最小限に抑える質量分析用サンプルを生成する効率的な方法です。サンプル調製のSP3法によって可能になる回復の増加は、検出限界に近いタンパク質を定量するためのこのワークフローで有用な代替手段であり得る。
このプロテオミクスワークフローは、キナーゼ、E3ユビキチンリガーゼ、マルチサブユニット複合体の足場メンバーを含む多くの核餌に適用されています。抗体試薬の適切な検証を前提として、このワークフローを正常に実行すると、目的のタンパク質に対する高信頼タンパク質核相互作用パートナーの検出が得られます。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、リンダ・クニック・インスティテュート・オブ・ダウン症候群のW.M.O.に対するグランドチャレンジ補助金と、DARPA協力協定13-34-RTA-FP-007によって支援されました。ジェシー・カーランドとキラ・コッツォリーノの原稿の読み取りとコメントに貢献してくれたことに感謝します。
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
1.5 ml low-rention microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
4-20% Mini PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561096 | |
acetone (HPLC) | Thermo Fisher Scientific | A949SK-4 | |
Amicon Ultra 0.5 ml 30k filter column | Millipore Sigma | UFC503096 | |
Benzamidine | Sigma-Aldrich | 12072 | |
benzonase | Sigma-Aldrich | E1014 | |
Chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
Dialysis tubing closure | Caroline Biological Supply Company | 684239 | |
DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | Sc-47724 | |
Glycerol | Fisher Scientific | 887845 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
HeLa QC tryptic digest | Pierce | 88329 | |
HEPES | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
KONTES Dounce homogenizer 7 ml | VWR | KT885300-0007 | |
Large Clearance pestle 7ml | VWR | KT885301-0007 | |
Lysyl endopeptidase C | VWR | 125-05061 | |
Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | |
Microcystin | enzo life sciences | ALX-350-012-C100 | |
Nonidet P 40 Substitute solution | Sigma-Aldrich | 98379 | |
p84 antibody | GeneTex | GTX70220 | |
Phosphate Buffered Saline | |||
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
Pierce BSA Protein Digest, MS grade | Thermo Fisher Scientific | 88341 | LCMS QC |
Pierce C18 spin columns | Thermo Fisher Scientific | PI-89873 | |
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Fisher Scientific | 90057 | For mass spectrometry sample prep |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0780-01 | |
Protein G Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0618-01 | |
SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
Silica emitter tip | Pico TIP | FS360-20-10 | |
Small Clearance pestle 7ml | VWR | KT885302-0007 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | 31448 | |
Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | |
Spectra/ Por 8 kDa 24 mm dialysis tubing | Thomas Scientific | 3787K17 | |
TC Dish 150, Standard | Sarstedt | 83.3903 | Tissue culture dish for adherent cells |
TCA | Sigma-Aldrich | T9159 | |
TCEP | Thermo Scientific | PG82080 | |
TFA | Thermo Fisher Scientific | 28904 | |
Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS | Thermo Fisher Scientific | ||
Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
Urea | Thermo Fisher Scientific | 29700 | |
Waters ACQUITY M-Class UPLC | Waters | ||
Waters ACQUITY UPLC M-Class Column Reversed-Phase 1.7µm Spherical Hybrid (1.7 µm, 75 µm x 250 mm) | Waters | 186007484 | nanoflow C18 column |