هذا البروتوكول يتيح الأمثل والجيل اللاحق كفاءه من الكسور النووية والسيتوبلازمي من خلايا سرطان الدم اللمفاوية المزمنة الاوليه. وتستخدم هذه العينات لتحديد توطين البروتين وكذلك التغيرات في الاتجار بالبروتين الذي يحدث بين المقصورات النووية والخلوية علي تحفيز الخلايا والعلاج من المخدرات.
وغالبا ما يتم تحرير الصادرات النووية من الجزيئات في الخلايا السرطانية. يمكن جعل البروتينات المثبطة للورم ، مثل p53 ، غير نشطه بسبب التعريب الخلوي الشاذ الذي يعطل اليه عملها. ويساعد علي بقاء خلايا سرطان الدم اللمفاوية المزمنة (CLL) ، من بين الخلايا السرطانية الأخرى ، من خلال تحرير الاسلحه النووية إلى المكوكات الخلوية ، علي الأقل جزئيا عن طريق إلغاء القيود التي XPO1 مستقبلات النقل والتنشيط التاسيسي مسارات الإشارات بوساطة PI3K. من الضروري فهم دور البروتينات الفردية في سياق موقعها داخل الخلايا للحصول علي فهم أعمق لدور هذه البروتينات في البيولوجيا المرضية للمرض. وعلاوة علي ذلك ، فان تحديد العمليات التي تكمن وراء تحفيز الخلايا واليه العمل لمثبطات دوائية محدده ، في سياق الاتجار بالبروتين دون الخلوي ، سيوفر فهما اشمل لليه العمل. البروتوكول الموصوف هنا يتيح الأمثل والجيل التالي الفعال من الكسور النووية والسيتوبلازمية من خلايا سرطان الدم اللمفاوية المزمنة الاوليه. ويمكن استخدام هذه الكسور لتحديد التغيرات في الاتجار بالبروتين بين الكسور النووية والخلايا الخلوية علي تحفيز الخلية والعلاج من المخدرات. ويمكن قياس البيانات كميا وعرضها بالتوازي مع صور النيون المناعية ، التالي توفير بيانات قويه وقابله للقياس الكمي.
وقد أنشئت لفتره طويلة نقل الجزيئات بين النواة والخلايا الخلوية للعب دورا رئيسيا في وظيفة الخلية العادية ، وغالبا ما يتم تحريرها في الخلية السرطانية1,2. ويمكن ان تنجم هذه القيود عن الإفراط في التعبير/طفرة البروتينات التي تتحكم في التصدير النووي. واحد من هذه البروتين اكسبورتين (XPO1) ، هو مستقبلات النقل التي تصدر > 200 اشاره التصدير النووية (NES)-التي تحتوي علي البروتينات في السيتوبلاسما من النواة2. XPO1-cargos تشمل الp53 ، وافراد الاسره foxo و IB ، والمساهمة في عدم تفعيلها عن طريق تثبيط أليتها للعمل1،2،3. يمكن ان يحدث المزيد من البروتين الخاطئ عندما الإشارات البيئية الدقيقة تؤثر علي الخلايا السرطانية ، مما يؤدي إلى تنشيط مسارات الإشارات داخل الخلايا مثل الفوسفاتيديل-اينوزيتول-3-كيناز (PI3K)/المسار akt ، مما ادي إلى التنشيط من [فوكسو] أسره أعضاء وتصدير لاحقه من النواة4,5. وقد تورط هذا الخطا من البروتينات المثبطة الورم في تطور عدد من الأورام الدموية والصلبة1,2,6.
تطوير مثبطات جزيء صغير للاستخدام السريري في الأورام الخبيثة الدموية (ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML)/cll) ، والتي ترتبط وتمنع بشكل انتقائي وظيفة XPO1 ، ويؤكد علي اهميه تطوير التقنيات المناسبة لمعالجه تاثير العوامل الدوائية علي إغلاق البروتينات بين المقصورات النووية والسيتوبلازمية6،7،8. وقد أحرزت تقنيات التصوير تقدما كبيرا مما مكن من تحديد البروتينات في المقصورات شبه الخلوية علي التحفيز الخارجي لعلاج المخدرات ، ومع ذلك ، فان اهميه التقنيات الموازية القوية والداعمة أمر بالغ الاهميه لموثوقيه اعلام الجمهور العلمي بصحة النتيجة.
اللمفاويات يستريح والخبيثة CLL-B الخلايا المعزولة من عينات الدم المريض تمثل تحديا في توليد الكسور النووية والسيتوبلازمية بسبب ارتفاع النووية: نسبه سيتوبلازمي. ان الاستفادة المثلي من الظروف التجريبية لتوليد بيانات تجريبية قويه وموثوقه أمر بالغ الاهميه بالطبع من أجل تخطيط البرامج التجريبية في المستقبل. الطريقة الموصوفة هنا تمكن القياس الكمي للبروتينات في الكسور النووية والخلوية وتحدد كيف يمكن ان تتاثر هذه البروتينات بالتحفيز الخلوي و/أو العلاج بالمخدرات.
ويوفر البروتوكول الموصوف طريقه سريعة وفعاله لتوليد الكسور النووية والسيتوبلازمية من خلايا CLL الاوليه ، والكمية اللاحقة من الاتجار بالبروتين بين الكسور النووية والجزيئات الخلوية عند تحفيز الخلايا والعلاج بالمخدرات. وتبين البيانات المقدمة القدرة علي الكشف عن الاتجار بالبروتينات المحددة ، علي سبيل المثال ، FOXO1 ، بين الكسور النووية والجزيئات السيتوبلازمية ، عند المعالجة بمثبط ثنائي mTOR AZD8055 في وجود/غياب التقاطع BCR من خلال F ( ab ‘)2 التحفيز جزء (الشكل 3 والشكل 4). اقتران هذه التجارب مع القياس الكمي من البقع الغربية من عينات المريض CLL الفردية ، وتمكن التحليلات الموضوعية للبيانات المتولدة ويوضح متانة الفحص الموصوفة لتحديد التغيرات العالمية في توطين البروتين في خلايا CLL معزولة عن أفواج المرضي (الشكل 4). ومن الواضح من البيانات ان متوسط خمس عينات من المرضي في الكسور السيتوبلازمية وصلت بالقرب من الاهميه. النظر إلى التغاير السريري لمرضي CLL11، فان هذه التحاليل عاده ما يتم اجراؤها علي المجموعات الأكبر من المرضي ، و/أو تركز علي مجموعات فرعيه نذير محدده للمرضي للحصول علي فهم اوفي للاستجابة الخلوية من cll خلايا لعلاجات المخدرات المحددة.
البيانات المقدمة تثبت اهميه اختيار علامات البروتين التي تعيش حصرا في الكسور الخلوية أو النووية ، كما سيتم تاكيد نقاء تجزئه من قبل هذه العلامات. تم اختيار β-الأنابيب لتاكيد الكسر سيتوبلازمي ، ولامين A/C كعلامة النووية. البروتينات الاضافيه التي يشيع استخدامها هي الفجوة و α-الأنابيب لتحديد الجزء السيتوبلازمي أو Brg1 (SMARCA4) ، tfiid والحمض النووي الريبي الثاني لنقاء الكسر الذري4،5. ومع ذلك ، يجب توخي الحذر عند اختيار البروتينات التي يتم تخصيبها بشكل كبير في كسور معينه ، وليست موجودة في كلا الكسور (علي سبيل المثال ، γ) (الشكل 2ج)9. وفي الواقع ، فانه في حين تعتبر البروتينات السيتوبلازمية والمثبطة للخلايا الخلوية بشكل عام قادره علي التوطين في النواة12،13، فانها تسلط الضوء علي اهميه اختيار علامة كسر لا تنتقل عند التحفيز أو العلاج تطبيقها علي الخلايا. علاوة علي ذلك ، من المهم التاكد من ان علامة البروتين المختارة يتم التعبير عنها في خليه الاهتمام عن طريق تشغيل WCL إلى جانب التجزئة تحت الخلوي.
وفي التجربة التمثيلية المبينة ، استخدم نفس العدد من خلايا CLL لكل حاله (التحفيز/العلاج بالعقاقير) ، وبعد ذلك أعدت عينات التجزئة علي الفور. تحميل 10 ميكروغرام من البروتين المجزا/حاره يوفر المواد الكافية للكشف عن البروتينات من الفائدة. ونظرا لان هذه العينات خضعت فقط لعلاج المخدرات علي المدى القصير والتحفيز (حتى 4 ساعات) ، فقد افترض ان مستوي البروتين سيبقي كما هو في كل عينه ، ولم يتم اجراء فحص البروتين. ومع ذلك ، إذا تم تمديد العلاجات الخلوية (18-72 h) ، فان مستوي موت الخلايا أو الانتشار في الخلايا قد يغير بشكل كبير من نوعيه وكميه البروتين المستخرج ، ويعتمد علي تحفيز الدواء/الخلية المطبق ، التالي تغيير مستويات البروتين في المعالجة /العينات المحفزة. في هذه الحالات لعلاج المخدرات علي المدى الطويل ، فانه من المستحسن لتنفيذ الكمية البروتين باستخدام المقايسة برادفورد أو ما يعادلها ، قبل التنقيط الغربية لضمان يتم تشغيل نفس الكمية من البروتين في كل حاره من المناعة. وجود المنظفات قد تتداخل مع اختبارات البروتين المحددة14، ويمكن تقليل هذا التداخل عن طريق تمييع عينات البروتين جزء الخلية. الاضافه إلى ذلك ، استخدم المخزن المؤقت تحلل كامله كالفارغة ، باستخدام نفس التخفيف كما هو الحال في العينات التي يتم اختبارها.
لتقديم الادله الداعمة للنتائج الموصوفة هنا ، يمكن اجراء تجارب موازيه باستخدام المجهر الفلوري لتحليل موقع FOXO1 داخل خلايا CLL لتمكين تصور هذه النتائج5. وعلاوة علي ذلك ، يمكن أيضا استخدام الكسور الخلوية التي تم إنشاؤها لاختبارات نشاط الانزيم أو تحليل البروتينات في التحاليل اللاحقة.
The authors have nothing to disclose.
ويود المؤلفون ان يشكروا الدكتورة ناتاشا مالك علي مراجعتها النقدية لهذه المخطوطة. تم تمويل هذه الدراسة من قبل منحه المشروع الدموي منحت إلى AMM (18003). وقامت مؤسسه حوات بتمويل مرافق التحليل الخاصة بهذه المراكز. تم تمويل MWM من قبل دكتوراه في الدراسة من أصدقاء بول O’Gorman مركز أبحاث سرطان الدم, وقد تم تمويل JC من قبل مركز أبحاث اللوكيميا أصدقاء بول O’Gorman وتم تمويل JH من قبل منحه المشروع الدموي (18003).
1.5 mL microcentrifuge Tubes | Griener Bio one | 616201 | |
3 mL Pasteur Pipettes | Griener Bio one | 612398 | |
12 mm x 75 mm FACS Tubes | Elkay | 2052-004 | |
15 mL Tube | Griener Bio one | 188271 | |
50 mL Tube | Griener Bio one | 227261 | |
anti-CD5 FITC antibody | BD Biosciences | 555352 | phenotypic surface marker |
anti-CD19 PE Cy7 antibody | BD Biosciences | 557835 | phenotypic surface marker |
anti-CD23 APC antibody | BD Biosciences | 558690 | phenotypic surface marker |
anti-CD45 APC Cy7 antibody | BD Biosciences | 557833 | phenotypic surface marker |
anti-β-Tubulin antibody | Cell Signaling | 2146 | cytoplasmic marker |
anti-γ-Tubulin Mouse antibody (clone GTU-88) | Sigma-Aldrich | T5326 | |
anti-FoxO1 (C29H4) Rabbit antibody | Cell Signaling | 2880 | |
anti-Lamin A/C antibody | Cell Signaling | 2032 | nuclear marker |
anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | Secondary antibody |
anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody |
anti-Rpb1 CTD antibody (clone 4H8) | Cell Signaling | 2629 | nuclear marker |
BDFACS Canto II | BD Biosciences | By Request | Flow Cytometer |
DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | live/dead discriminator |
DMSO | Sigma | D2650 | |
EDTA | Sigma | EDS | |
Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 10500064 | |
GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | Software | |
Histopaque1077 density gradient media | Sigma | H8889 | |
HyperPAGE 10 – 190 kDa protein marker | Bioline | BIO-33066 | Molecular weight marker |
Image Studio Lite (version 5.2.5) | LI-COR | www.licor.com | Software |
Labnet VX100 | Fisher Scientific | Vortex | |
Nucelar Extract Kit | Active Motif | 40010 | |
OneComp eBeads | Thermofisher | 01-111-42 | |
Trypan Blue Solution | Thermofisher | 15250061 | |
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26619 | Molecular weight marker |
PBS Tablets | Fisher Scientific | BR0014G | |
RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15064 | |
Sigma 3-16P | SciQuip | Centrifuge | |
Sigma 1-15PK | SciQuip | Centrifuge |