このプロトコルは、原発性慢性リンパ球性白血病細胞からの核および細胞質画分の最適化およびその後の効率的な生成を可能にする。これらのサンプルは、タンパク質の局在化と、細胞刺激および薬物治療時に核と細胞質区画の間で起こるタンパク質の密売の変化を決定するために使用されます。
高分子の核輸出は、がん細胞でしばしば規制解除される。p53のような腫瘍抑制タンパク質は、その作用機序を破壊する異常な細胞局在化のために非アクティブにすることができる。慢性リンパ球性白血病(CLL)細胞の生存は、他の癌細胞の中でも、細胞質シャトルへの核の自由化によって支援され、少なくとも部分的には輸送受容体XPO1の規制緩和および構成的活性化を通じてPI3K媒介シグナリング経路。疾患の病態生物学におけるそのようなタンパク質の役割をより深く理解するためには、細胞内位置の文脈における個々のタンパク質の役割を理解することが不可欠である。さらに、細胞刺激の根には、細胞内タンパク質の密売の文脈において、細胞刺激および特定の薬理学的阻害剤の作用機序の下にあるプロセスを同定することは、そのメカニズムのより包括的な理解を提供する。アクション。ここで説明するプロトコルは、原発性慢性リンパ球性白血病細胞からの核および細胞質画分の最適化およびその後の効率的な生成を可能にする。これらの画分は、細胞刺激および薬物治療における核と細胞質画分の間のタンパク質取引の変化を決定するために使用することができる。データは、免疫蛍光画像と並行して定量化および提示できるため、堅牢で定量化可能なデータを提供できます。
核と細胞質の間の高分子の輸送は、長い間、正常な細胞機能において重要な役割を果たすことが確立されており、癌細胞1、2でしばしば調節解除される。このような規制緩和は、核輸出を制御するタンパク質の過剰発現/突然変異に起因する可能性があります。そのようなタンパク質Exportin-1(XPO1)の1つは、核2から細胞質に>200核輸出シグナル(NES)含有タンパク質を輸出する輸送受容体である。XPO1貨物は、p53、FOXO家族およびIBを含み、作用1、2、3のそれらのメカニズムを阻害することによってそれらの不活性化に寄与する。さらにタンパク質の誤局性は、微小環境シグナルが癌細胞に影響を与える場合に起こり得る、ホスファチジル-イノシトール-3-キナーゼ(PI3K)/Akt経路などの細胞内シグナル伝達経路の活性化につながり、FOXOファミリーメンバーの不活性化と核4、5からのその後のエクスポート。このような腫瘍抑制タンパク質の誤局化は、多数の血液学的および固形腫瘍1,2,6の進行に関与している。
XPO1機能に結合し選択的に阻害する血液性悪性悪性腫瘍(急性骨髄性白血病(AML)/CLL)における臨床用低分子阻害性阻害薬の開発は、核と細胞質のコンパートメント間のタンパク質のシャトルに対する薬理学的薬剤の影響6,7,8.イメージング技術は、薬物治療の外部刺激時に細胞内のタンパク質の同定を有意に可能にするが、堅牢で支持的な並列技術の重要性は、確実に重要である。結果の妥当性を科学的な聴衆に知らせる。
患者の血液サンプルから単離された安静リンパ球および悪性CLL-B細胞は、高い核による核および細胞質画分の生成における課題を表す:細胞質比。堅牢で信頼性の高い実験データを生成するための実験条件の最適化は、将来の実験プログラムを計画するためにはもちろん重要です。ここで説明する方法は、核および細胞質画分におけるタンパク質の定量を可能にし、これらのタンパク質が細胞刺激および/または薬物治療によってどのように影響を受けるかを決定する。
記載されたプロトコルは、一次CLL細胞からの核および細胞質画分の生成のための迅速かつ効率的な方法を提供し、その後の細胞刺激時の核と細胞質分画の間のタンパク質の結合の定量化そして薬物治療。提示されたデータは、Fを介したBCR架橋の有無において、二重mTOR阻害剤AZD8055を用いた治療時に、核分画と細胞質画分の間の特定のタンパク質の人身売買を検出する能力を示しています。ab’)2フラグメント刺激(図3および図4)。これらの実験を個々のCLL患者サンプルからウェスタンブロットの定量化と結合することで、生成されたデータの客観的な分析を可能にし、タンパク質局在化における世界的な変化を定量化するために記載されたアッセイの堅牢性を実証する患者コホートから単離されたCLL細胞(図4)。細胞質画分の平均5つの患者サンプルがほぼ有意に達していることはデータから明らかである。CLL患者11の臨床的不均一性を考えると、これらの分析は通常、より大きな患者コホートで行われ、CLLの細胞応答のより完全な理解を得るために患者の特定の予後サブグループに焦点を当てた。特定の薬物治療に細胞。
提示されたデータは、分画の純度がこれらのマーカーによって確認されるにつれて、細胞質分画または核画分のいずれに排他的に存在するタンパク質マーカーを選択することの重要性を示す。β-チューブリンは細胞質画分確認に選ばれ、ラミンA/Cは核マーカーとして選ばれた。一般的に使用される追加のタンパク質は、細胞質画分またはBrg1(SMARCA4)、TFIIDおよびRNAポリメラーゼIIの核画分純度4、5を同定するためにGAPDHおよびα-チューブリンである。しかし、特定の画分で非常に濃縮されたタンパク質を選択する際には注意が必要であり、両方の画分(例えば、γ-tubulin)に存在しない(図2C)9。実際、GAPDHおよびアクチンは、一般的に細胞質タンパク質であると考えられているが、核12、13に局所化することができ、刺激または治療時に再配置しない分画マーカーを選択することの重要性を強調し、セルに適用されます。さらに、選択したタンパク質マーカーが細胞内画分画と共にWCLを実行することによって目的の細胞内で発現していることを確認することが重要である。
示した代表的な実験では、各条件(刺激/薬物治療)に同数のCLL細胞を用い、その後、分画試料を直ちに調製した。分画タンパク質/レーンの10 μgをロードすると、目的のタンパク質を検出するのに十分な材料が提供されます。これらのサンプルは、短期的な薬物治療と刺激(最大4時間)しか受けていないため、タンパク質レベルは各試料で同じままであり、タンパク質アッセイは行われなかった。しかし、細胞治療が延長された場合(18~72時間)、細胞内の細胞死または増殖のレベルは、適用される薬物/細胞刺激に依存して抽出されたタンパク質の質と量を著しく変化させ、治療中のタンパク質レベルを変化させる可能性がある。/刺激されたサンプル。これらの長期的な薬物治療の場合、ブラッドフォードアッセイまたは同等のタンパク質定量を用いて、ウェスタンブロッティングの前に、同じ量のタンパク質が免疫ブロットの各レーンで実行されることを確実にすることをお勧めします。洗剤の存在は、特定のタンパク質アッセイ14に干渉し得るが、この干渉は細胞分画タンパク質サンプルを希釈することによって低減することができる。さらに、完全なリシスバッファーをブランクとして使用し、試験対象のサンプルと同じ希釈を使用します。
ここで説明する知見の裏付けとなる証拠を提供するために、蛍光顕微鏡を用いて並列実験を行い、CLL細胞内のFOXO1の位置を解析し、これらの知見の可視化を可能にした5.さらに、生成された細胞下画分は、さらに下流分析における酵素活性アッセイまたはプロテオミクス分析にも使用することができる。
The authors have nothing to disclose.
著者たちは、原稿を批判的に見直してくれたナターシャ・マリク博士に感謝したいと思います。この研究は、AMM(18003)に授与されたブラッドワイズプロジェクト助成金によって資金提供されました。FACS分析施設は、ハウアット財団が資金を提供しました。MWMはポール・オゴーマン白血病研究センターのフレンズから博士課程の学生によって資金提供され、JCはポール・オゴーマン白血病研究センターのフレンズから資金提供を受け、JHはブラッドワイズプロジェクト助成金(18003)によって資金提供されました。
1.5 mL microcentrifuge Tubes | Griener Bio one | 616201 | |
3 mL Pasteur Pipettes | Griener Bio one | 612398 | |
12 mm x 75 mm FACS Tubes | Elkay | 2052-004 | |
15 mL Tube | Griener Bio one | 188271 | |
50 mL Tube | Griener Bio one | 227261 | |
anti-CD5 FITC antibody | BD Biosciences | 555352 | phenotypic surface marker |
anti-CD19 PE Cy7 antibody | BD Biosciences | 557835 | phenotypic surface marker |
anti-CD23 APC antibody | BD Biosciences | 558690 | phenotypic surface marker |
anti-CD45 APC Cy7 antibody | BD Biosciences | 557833 | phenotypic surface marker |
anti-β-Tubulin antibody | Cell Signaling | 2146 | cytoplasmic marker |
anti-γ-Tubulin Mouse antibody (clone GTU-88) | Sigma-Aldrich | T5326 | |
anti-FoxO1 (C29H4) Rabbit antibody | Cell Signaling | 2880 | |
anti-Lamin A/C antibody | Cell Signaling | 2032 | nuclear marker |
anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | Secondary antibody |
anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody |
anti-Rpb1 CTD antibody (clone 4H8) | Cell Signaling | 2629 | nuclear marker |
BDFACS Canto II | BD Biosciences | By Request | Flow Cytometer |
DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | live/dead discriminator |
DMSO | Sigma | D2650 | |
EDTA | Sigma | EDS | |
Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 10500064 | |
GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | Software | |
Histopaque1077 density gradient media | Sigma | H8889 | |
HyperPAGE 10 – 190 kDa protein marker | Bioline | BIO-33066 | Molecular weight marker |
Image Studio Lite (version 5.2.5) | LI-COR | www.licor.com | Software |
Labnet VX100 | Fisher Scientific | Vortex | |
Nucelar Extract Kit | Active Motif | 40010 | |
OneComp eBeads | Thermofisher | 01-111-42 | |
Trypan Blue Solution | Thermofisher | 15250061 | |
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26619 | Molecular weight marker |
PBS Tablets | Fisher Scientific | BR0014G | |
RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15064 | |
Sigma 3-16P | SciQuip | Centrifuge | |
Sigma 1-15PK | SciQuip | Centrifuge |