Este protocolo permite a otimização e a geração eficiente subseqüente de frações nucleares e cytoplasmic das pilhas crônicas primárias da leucemia lymphocytic. Estas amostras são usadas para determinar a localização da proteína assim como mudanças no tráfico da proteína que acontecem entre os compartimentos nucleares e cytoplasmic em cima da estimulação da pilha e do tratamento da droga.
A exportação nuclear de macromoléculas é muitas vezes desegulada em células cancerosas. As proteínas do supressor do tumor, tais como p53, podem ser tornados inativos devido à localização celular aberrante que interrompe seu mecanismo da ação. A sobrevida de células Crônicas de leucemia linfocítica (LLC), entre outras células cancerosas, é assistida pela desregulamentação de shuttling nuclear para citoplasma, pelo menos em parte através da desregulação do receptor de transporte XPO1 e a ativação constitutiva de Vias de sinalização mediadas por PI3K. É essencial compreender o papel das proteínas individuais no contexto de sua localização intracelular para obter uma compreensão mais profunda do papel de tais proteínas na patología da doença. Além disso, a identificação de processos que sustentam a estimulação celular e o mecanismo de ação de inibidores farmacológicos específicos, no contexto do tráfico de proteínas subcelulares, proporcionará uma compreensão mais abrangente do mecanismo de Ação. O protocolo descrito aqui permite a optimização e a geração eficiente subseqüente de frações nucleares e cytoplasmic das pilhas crônicas primárias da leucemia lymphocytic. Essas frações podem ser usadas para determinar mudanças no tráfico de proteínas entre as frações nuclear e citoplasmática após estimulação celular e tratamento medicamentoso. Os dados podem ser quantificados e apresentados em paralelo com as imagens imunofluorescentes, proporcionando assim dados robustos e quantificáveis.
O transporte de macromoléculas entre o núcleo e o citoplasma tem sido estabelecido há muito tempo para desempenhar um papel fundamental na função celular normal e muitas vezes é desegulado em células cancerosas1,2. Tal desregulação pode resultar de superexpressão/mutação de proteínas que controlam a exportação nuclear. Uma dessas proteínas exportin-1 (XPO1), é um receptor de transporte que exporta > 200 proteínas contendo o sinal de exportação nuclear (NES) para o citoplasma do núcleo2. XPO1-cargas incluemp53, membrosda família Foxo e IB, contribuindo para sua inativação inibindo seu mecanismo de ação1,2,3. A deslocalização da proteína mais adicional pode ocorrer quando os sinais microambientais impinge em cima das pilhas de cancro, conduzindo à ativação de vias de sinalização intracelular tais como a via do Phosphatidyl-inositol-3-kinase (PI3K)/Akt, tendo por resultado inativação de membros da família Foxo e subsequente exportação do núcleo4,5. Tal seu de proteínas do supressor do tumor foi implicada na progressão de um número de tumores hematológicos e contínuos1,2,6.
O desenvolvimento de inibidores pequenos da molécula para o uso clínico em malignidades hematológicas (leucemia Myeloid aguda (AML)/CLL), que ligam e inibem seletivamente a função XPO1, sublinha a importância de desenvolver técnicas apropriadas para endereçar o impacto dos agentes farmacológicos no shuttling das proteínas entre os compartimentos nucleares e cytoplasmic6,7,8. As técnicas da imagem latente avançaram significativamente permitindo a identificação das proteínas em compartimentos subcellular em cima da estimulação externa de tratamentos da droga, entretanto, a importância de técnicas paralelas robustas e de suporte é crítica para confiantemente informar um público científico da validade de um resultado.
Linfócitos em repouso e células CLL-B malignas isoladas de amostras de sangue do paciente representam um desafio na geração de frações nucleares e citoplasmáticas devido à alta relação nuclear: citoplasmática. A otimização das condições experimentais para gerar dados experimentais robustos e confiáveis é, naturalmente, crítica para planejar futuros programas experimentais. O método descrito aqui possibilita a quantificação de proteínas nas frações nuclear e citoplasmática e determina como essas proteínas podem ser impactadas pela estimulação celular e/ou tratamento medicamentoso.
O protocolo descrito fornece um método rápido e eficiente para a geração de frações nucleares e cytoplasmic das pilhas preliminares de CLL, e a quantificação subseqüente do tráfico da proteína entre as frações nucleares e cytoplasmic em cima da estimulação da pilha e tratamento medicamentoso. Os dados apresentados demonstram a capacidade de detectar o tráfico de proteínas específicas, por exemplo, FOXO1, entre as frações nuclear e citoplasmática, após o tratamento com um inibidor de mTOR duplo AZD8055 na presença/ausência de reticulação do BCR através de F ( AB ‘)2 estimulação do fragmento (Figura 3 e Figura 4). O acoplamento desses experimentos com a quantificação de manchas ocidentais de amostras individuais de pacientes com LLC, possibilita análises objetivas dos dados gerados e demonstra a robustez do ensaio descrito para quantificar mudanças globais na localização de proteínas em Células CLL isoladas de coortes de pacientes (Figura 4). É desobstruído dos dados que uma média de cinco amostras pacientes nas frações cytoplasmic alcançou o significado próximo. Dada a heterogeneidade clínica dos pacientes com LLC11, essas análises seriam normalmente realizadas em coortes de pacientes maiores, e/ou concentradas em subgrupos prognósticos específicos para obter uma compreensão mais completa da resposta celular da CLL células para tratamentos medicamentoso específicos.
Os dados apresentados demonstram a importância da escolha de marcadores proteicos que residem exclusivamente nas frações citoplasmáticas ou nucleares, pois a pureza do fracionamento será confirmada por esses marcadores. o β-tubulin foi escolhido para a confirmação citoplasmática da fração, e lamin A/C como um marcador nuclear. Proteínas adicionais comumente utilizadas são GAPDH e α-tubulin para identificar a fração citoplasmática ou Brg1 (SMARCA4), TFIID e RNA polimerase II para a pureza da fração nuclear4,5. No entanto, deve-se tomar cuidado ao escolher proteínas altamente enriquecidas em frações específicas e não presentes em ambas as frações (por exemplo, γ-tubulina) (Figura 2C)9. De fato, GAPDH e actina, emborageralmente considerados proteínas citoplasmáticas, podem localizar o núcleo12,13, destacandoa importância da escolha de um marcador de fração que não se desloque quando a estimulação ou o tratamento é aplicadas às células. Além disso, é importante confirmar que o marcador de proteína escolhido é expresso na célula de interesse, executando a WCL ao lado dos fraccionamentos subcelulares.
No experimento representativo mostrado, o mesmo número de células CLL foi utilizado para cada condição (estimulação/tratamento medicamentoso) e, posteriormente, as amostras de fracionamento foram preparadas imediatamente. O carregamento de 10 μg de proteína/pista fraccionada fornece material suficiente para a detecção das proteínas de interesse. Como essas amostras só se submeteram a um tratamento medicamentoso de curto prazo e estimulação (até 4 h), assumiu-se que o nível de proteína permaneceria o mesmo em cada amostra, e um ensaio protéico não foi realizado. No entanto, se os tratamentos celulares são estendidos (18-72 h), o nível de morte celular ou proliferação nas células pode alterar significativamente a qualidade e quantidade de proteína extraída, dependente da estimulação medicamentosa/celular aplicada, alterando assim os níveis de proteína no Tratado /amostras estimuladas. Nestes casos para tratamentos de droga a longo prazo, é aconselhável realizar a quantificação da proteína usando um ensaio de Bradford ou equivalente, antes da mancha ocidental para assegurar-se de que a mesma quantidade de proteína esteja executada em cada pista do immunoblot. A presença de detergentes pode interferir com os ensaios proteicos específicos14, esta interferência pode ser reduzida diluindo amostras da proteína da fração da pilha. Além disso, use o tampão de Lise completo como o espaço em branco, usando a mesma diluição como nas amostras que estão sendo testadas.
Para fornecer evidências de suporte para os achados descritos aqui, experimentos paralelos poderiam ser realizados utilizando microscopia de fluorescência para analisar a localização de FOXO1 dentro das células CLL para possibilitar a visualização desses achados5. Além disso, as frações subcelulares geradas também podem ser usadas para ensaios de atividade enzimática ou análise proteômica em análises posteriores a jusante.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer a Dr. Natasha Malik por rever criticamente o manuscrito. Este estudo foi financiado por uma subvenção do projeto Bloodwise concedida à AMM (18003). As instalações de análise da FACS foram financiadas pela Fundação Howat. MWM foi financiado por um Studentship PhD de Friends of Paul o ‘ Gorman Leukaemia Research Centre, JC foi financiado pelo Friends of Paul o ‘ Gorman Leukaemia Research Centre e JH foi financiado por uma concessão de projeto Bloodwise (18003).
1.5 mL microcentrifuge Tubes | Griener Bio one | 616201 | |
3 mL Pasteur Pipettes | Griener Bio one | 612398 | |
12 mm x 75 mm FACS Tubes | Elkay | 2052-004 | |
15 mL Tube | Griener Bio one | 188271 | |
50 mL Tube | Griener Bio one | 227261 | |
anti-CD5 FITC antibody | BD Biosciences | 555352 | phenotypic surface marker |
anti-CD19 PE Cy7 antibody | BD Biosciences | 557835 | phenotypic surface marker |
anti-CD23 APC antibody | BD Biosciences | 558690 | phenotypic surface marker |
anti-CD45 APC Cy7 antibody | BD Biosciences | 557833 | phenotypic surface marker |
anti-β-Tubulin antibody | Cell Signaling | 2146 | cytoplasmic marker |
anti-γ-Tubulin Mouse antibody (clone GTU-88) | Sigma-Aldrich | T5326 | |
anti-FoxO1 (C29H4) Rabbit antibody | Cell Signaling | 2880 | |
anti-Lamin A/C antibody | Cell Signaling | 2032 | nuclear marker |
anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | Secondary antibody |
anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody |
anti-Rpb1 CTD antibody (clone 4H8) | Cell Signaling | 2629 | nuclear marker |
BDFACS Canto II | BD Biosciences | By Request | Flow Cytometer |
DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | live/dead discriminator |
DMSO | Sigma | D2650 | |
EDTA | Sigma | EDS | |
Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 10500064 | |
GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | Software | |
Histopaque1077 density gradient media | Sigma | H8889 | |
HyperPAGE 10 – 190 kDa protein marker | Bioline | BIO-33066 | Molecular weight marker |
Image Studio Lite (version 5.2.5) | LI-COR | www.licor.com | Software |
Labnet VX100 | Fisher Scientific | Vortex | |
Nucelar Extract Kit | Active Motif | 40010 | |
OneComp eBeads | Thermofisher | 01-111-42 | |
Trypan Blue Solution | Thermofisher | 15250061 | |
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26619 | Molecular weight marker |
PBS Tablets | Fisher Scientific | BR0014G | |
RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15064 | |
Sigma 3-16P | SciQuip | Centrifuge | |
Sigma 1-15PK | SciQuip | Centrifuge |