Fractionnement subcellulaire des cellules de leucémie lymphocytique chronique primaire pour surveiller le trafic de protéines nucléaires/cytoplasmiques

L’utilisation d’échantillons primaires de patients atteints de LCL décrits ici a été approuvée par le West of Scotland Research Ethics Service, le NHS Greater Glasgow and Clyde (Royaume-Uni) et tous les travaux ont été effectués conformément aux lignes directrices approuvées. 1. Isolement des cellules CLL à partir d’échantillons de sang de patients Des échantillons de sang périphériques provenant de patients atteints de LCL précédemment consentis sont reçus de la clinique dans des tubes de collecte de sang EDTA, accompagnés du nombre de cellules blanches (WCC). Purifie les échantillons de Sang Périphérique CLL selon le COE. Pour le COE et 40 x 106 cellules/mL, passez à l’étape 1.1.1; pour le COE 40 x 106 cellules/mL, passez à l’étape 1.1.2. Verser le contenu de tous les tubes sanguins EDTA dans un tube conique de centrifugeuse de 50 ml et ajouter 50 l de cocktail d’enrichissement des cellules B humaine par 1 ml de sang. Incuber à température ambiante (RT) pendant 20 min. Procéder à l’étape 1.1.2. Diluer l’échantillon à un rapport de 1:1 avec le tampon de lavage RT CLL (salin tamponné par phosphate (PBS), 0,5 % de sérum bovin fœtal (SGF) et 2 mM EDTA). Aliquot RT densité gradient media dans un tube de centrifugeuse conique de taille appropriée pour l’échantillon (10 ml dans un tube de 50 ml pour 30 ml d’échantillon ou 4 ml dans un tube de 15 ml pour 10 ml d’échantillon). Couchez soigneusement l’échantillon au-dessus du support de gradient de densité et de la centrifugeuse à 400 x g pendant 30 min à RT.REMARQUE: Assurez-vous que la centrifugeuse est à RT avant que les échantillons soient placés dans la centrifugeuse comme un changement de température se traduira par un mauvais enrichissement des cellules mononucléaires, et éteindre le frein sur la centrifugeuse, comme le freinage soudain peut perturber l’interface liquide. Récoltez doucement la couche blanche de cellules mononucléaires qui s’accumulent à l’interface du support de gradient de densité et du tampon de lavage CLL, dans un tube de centrifugeuse conique frais de 50 ml à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique. Ajouter 40 ml de tampon de lavage CLL à la monocouche isolée pour laver les cellules et la centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à RT. Jeter le supernatant, resuspendre la pastille en faisant glisser le fond du tube, puis répéter l’étape de lavage décrite à l’étape 1.5. Jetez le supernatant, suspendez la pastille telle qu’elle est décrite à l’étape 1.6, puis suspendez la pastille dans un volume de tampon de lavage CLL (jusqu’à 40 ml, selon la taille de la pastille cellulaire). Comptez les cellules à l’aide du bleu trypan et d’un hémocytomètre. Ensuite, procéder à la cytométrie de flux pour vérifier la pureté des cellules CLL.REMARQUE: À ce stade, les cellules CLL peuvent être cultivées à une concentration de 10 x 106 cellules/mL dans les médias à utiliser dans des expériences, et / ou cryoconservé dans 10% de sulfoxyde de diméthyle (DMSO)/FBS pour les travaux futurs à des concentrations allant jusqu’à 100 x 106 cellules / flacon. 2. Cytométrie de flux des cellules de CLL Étiquette 12 mm x 75 mm tubes de polystyrène à fond rond comme décrit dans le tableau 1. Dans les tubes 2 à 5, mettre une goutte de perles de compensation et entreposer sur la glace. Ajouter 1 oL de l’anticorps approprié (anti-CD5, CD19, CD23 ou CD45, comme indiqué dans le tableau 1) aux tubes 2 à 5, et incuber sur la glace pendant 20 min, protégé de la lumière en plaçant du papier d’aluminium sur le seau à glace.REMARQUE: Ces tubes servent de contrôles de compensation pour la mise en place du modèle de cytométrie de flux. Mettre jusqu’à 1 x 106 cellules CLL dans les tubes 1, 6 et 7, ajouter 2 mL de tampon FACS (PBS – 2% FBS) à chaque tube et centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min à RT pour laver les cellules. Jetez le supernatant et rangez les tubes contenant des granulés de cellules sur la glace. Resuspendre les granulés cellulaires et ajouter la combinaison appropriée d’anticorps aux cellules du tube 7, comme indiqué dans le tableau 1, dans un volume final de 100 L avec tampon FACS. Les anticorps sont utilisés à une concentration appropriée selon les directives du fabricant. Resuspendre les granulés cellulaires dans les tubes 2 et 6 sur 100 l de tampon FACS. Incuber les cellules sur la glace, aux côtés des perles tachées dans les tubes 2 à 5, à l’abri de la lumière pendant 20 min. Après l’incubation, ajouter 2 mL de tampon FACS à tous les tubes et centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min à RT pour laver les cellules. Jeter le supernatant et resuspendre les boulettes de perles/cellules en faisant glisser doucement les tubes. Resuspendre les tubes 1 – 5 sur 100 ‘L de tampon FACS et placer sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à analyser sur le cytomètre d’écoulement. Diluer la solution DAPI à 0,05-0,2 g/mL dans le tampon FACS immédiatement avant l’utilisation. La concentration optimale peut varier, et la titration est recommandée. Resuspendre les tubes 6 et 7 avec 100 l de solution Diluée DAPI et incuber les tubes sur la glace pendant un minimum de 5 min pour permettre aux cellules de tacher.REMARQUE: Aucun autre lavage n’est nécessaire car le DAPI doit être présent dans le tampon pour que les cellules mortes restent étiquetées. Une fois que Le DAPI a été ajouté, les cellules doivent être analysées sur le cytomètre de flux dans un délai de 4 h. Analyser les cellules à l’aide d’un cytomètre d’écoulement. 3. Préparation des fractions subcellulaires des cellules CLL REMARQUE: Lors de la planification de la mise en place expérimentale, inclure un puits de cellules non stimulées / non traitées à partir de laquelle l’extrait de cellules entière s’agit peut être généré. Effectuer la stimulation souhaitée et/ou le traitement médicamenteux de la lignée cellulaire MEC1 CLL ou des cellules CLL primaires isolées à l’aide de 10 à 20 x 106 cellules/condition. Les cellules seront ensuite utilisées pour la fractionnement subcellulaire (étapes 3.4 et 3.5) ou pour générer de l’extrait de cellules entières (étape 3.6). Préparation des solutions/tubes : Préparer toutes les solutions/tampons fraîchement le jour de la fractionnement, avant que les cellules ne soient récoltées. Conserver les solutions sur la glace jusqu’à ce que nécessaire et l’utiliser dans les 4 h suivant la préparation. PBS/phosphatase inhibitor solution: Préparer les inhibiteurs de la phosphatase dans PBS en diluant les inhibiteurs de la phosphatase 1:20 dans 1x PBS (c.-à-d., 0,5 mL d’inhibiteurs de la phosphatase dans 9,5 mL de 1x PBS).REMARQUE: Assurez-vous que les inhibiteurs de la phosphatase n’ont pas précipité. Si un précipité est présent, chauffer jusqu’à 50 oC pendant 10 min. Tampon hypotonique : Préparer 1x tampon hypotonique en faisant une dilution de 1:10 de 10x tampon hypotonique dans l’eau distillée (c.-à-d., 50 ‘L de tampon hypotonique 10x en 450 ‘L de dH2O). 10 mM dithiothreitol (TNT) : Préparer 10 mM DTT en faisant une dilution de 1 m 100 de 1 M DTT avec de l’eau distillée (c.-à-d. 10 l de 1 M TNT sur 990 oL de dH2O).REMARQUE: La TNT est très labile, alors préparez-le à chaque fois. Évitez les cycles répétés de gel/dégel. Tampon de lyse complet : Déterminez la quantité de mémoire tampon requise pour chaque expérience. Chaque échantillon nécessite 50 l de tampon de lyse complète, alors ajoutez 5 l de 10 mL DTT (étape 3.2.3) à 44,5 ‘L de tampon de lyse, puis ajoutez 0,5 ‘L de cocktail inhibiteur de la protéase. Cette quantité peut être étendue en fonction du nombre d’échantillons dans l’expérience. Étiqueter quatre ensembles de tubes microfuge de 1,5 ml pour chaque traitement de stimulation et/ou de traitement médicamenteux pour les cellules fraîchement stimulées (étape 3.3), les fractions cytoplasmiques fraîchement générées (étape 3.4.3), les fractions nucléaires fraîchement générées (étape 3.5.3), et la cellule entière lysates (étape 3.6.3). Pré-réfrigérer ces tubes de microfuge sur la glace jusqu’à ce que nécessaire. Transférer les cellules dans des tubes de microfuge de 1,5 ml étiquetés individuellement et des granulés en centrifuge à 200 x g pendant 5 min à 4 oC. Retirez le supernatant et suspendez les cellules dans 1 ml d’inhibiteurs de la PBS/phosphatase à froid (étape 3.2.1). Pelleter les cellules par centrifugation à 200 x g pendant 5 min à 4 oC. Retirer le supernatant et garder les granulés de cellules sur la glace. Préparation des fractions cytoplasmiques : Resuspendre doucement les granulés cellulaires à utiliser pour la fractionnement subcellulaire dans 50 ‘L de 1x tampon hypotonique (étape 3.2.2). Incuber les cellules sur la glace pendant 15 min pour permettre aux cellules de gonfler.REMARQUE: Le volume de tampon hypotonique utilisé peut être augmenté empiriquement en fonction du nombre de cellules. Ajouter 0,8 à 2,5 L (1:20 à 1:60) de détergent dans chaque échantillon et vortex sur le réglage le plus élevé pour 10 s. Pour déterminer la concentration optimale de détergent à utiliser pour un type de cellule spécifique pour isoler les fractions nucléaires et cytoplasmiques, effectuer un gradient de détergent au départ. Une plage de 1:20 à 1:60 (c.-à-d. 2,5 à 0,8 l de détergent en 50 oL de tampon hypotonique) devrait être adéquate.REMARQUE : Si le volume de tampon hypotonique à l’étape 3.4 est ajusté, assurez-vous que le rapport détergent approprié est maintenu. Vérifier la lyse cellulaire en observant les cellules à l’aide d’un microscope à contraste de phase avant et après l’ajout de détergent. Les cellules entières semblent plus grandes avec un noyau dense et foncé. Le cytoplasme apparaîtra comme un halo lumineux autour du noyau.REMARQUE: La lyse appropriée est encore confirmée en utilisant le ballonnement occidental pour analyser des protéines spécifiques dans les fractions lysées générées par le gradient détergent. Une fois lysés, centrifuger les échantillons à 14 000 x g pour 30 s à 4 oC. Transférer délicatement le supernatant dans un tube de microfuge préréfrigéré et étiqueté. Cette fraction cytoplasmique peut être stockée à -80 oC jusqu’à ce qu’elle soit nécessaire pour une analyse plus approfondie. Le granule restant contient la fraction nucléaire (étape 3.5).REMARQUE: Évitez les cycles répétés de gel/dégel des échantillons. Préparation des fractions nucléaires : Resuspendre chaque granule nucléaire dans 50 l de tampon de lyse complète (étape 3.2.4) par pipetting de haut en bas.REMARQUE: Le volume de la mémoire tampon complète de lyse peut être ajusté empiriquement en fonction du nombre de cellules de départ. Ajouter 2,5 l de détergent pour solubiliser les protéines associées à la membrane nucléaire et le vortex sur le réglage le plus élevé pendant 10 s. Incuber les échantillons sur la glace pendant 30 min. Vortex sur le réglage le plus élevé pour 30 s, puis centrifuger les échantillons à 14.000 x g pendant 20 min à 4 oC. Transférer le supernatant dans un tube de microfuge préréfrigéré et étiqueté. Cette fraction nucléaire peut être stockée à -80 oC jusqu’à ce qu’elle soit nécessaire pour une analyse plus approfondie.REMARQUE: Évitez les cycles répétés de gel/dégel des échantillons. Préparation de lysates cellulaires entiers (WCL) à partir de cellules CLLREMARQUE: La préparation de l’extrait de cellule entier peut être effectuée en même temps que la préparation des fractions nucléaires (étape 3.5). Resuspendre l’extrait de cellules entières en 100 l de tampon complet de lyse (préparé à l’étape 3.2.4) en pipetting de haut en bas, puis ajouter 5 L de détergent pour assurer la lyse cellulaire complète. Incuber les échantillons sur la glace pendant 30 min. Vortex sur le réglage le plus élevé pour 30 s, puis centrifuger les échantillons à 14.000 x g pendant 20 min à 4 oC. Transférer le supernatant dans un tube de microfuge préréfrigéré. Ce lysate de cellule entière peut être stocké à -80 oC jusqu’à ce qu’il soit nécessaire pour une analyse plus approfondie.REMARQUE: Évitez les cycles répétés de gel/dégel des échantillons. 4. Analyse en aval des fractions subcellulaires REMARQUE: Dans ce protocole, l’analyse des fractions cellulaires générées a été effectuée par le ballonnement occidental à l’aide de protocoles standard, chargeant des nombres de cellules/voie égales (équivalent à 10 g de protéines) pour les fractions nucléaires et cytoplasmiques. Quantification du trafic de protéines entre les fractions nucléaires et cytoplasmiques : Effectuer l’analyse quantitative de la tache occidentale par quantitation de l’intensité du signal, ou densitométrie à l’aide d’un logiciel d’analyse de tache occidentale disponible gratuitement. Importation d’images : Les images western blot générées à partir de différents instruments en développement doivent être importées sous forme de fichiers JPG, PNG ou TIFF. Un fichier RAW de profondeur 16 bits est recommandé. Pour importer une image, cliquez sur l’icône du logiciel et planer sur Import. Cliquez ensuite sur Third-Party Images. Sélectionnez le fichier d’image et cliquez sur Ouvrez. Affichage de l’image: Dans le ruban Image, cliquez sur le bouton Choisissez dans le groupe Affichage. Le dialogue d’affichage d’ajustement s’ouvrira pour permettre d’autres ajustements si nécessaire. Implémentez des améliorations supplémentaires, y compris La luminosité ou le contraste, à l’aide des curseurs réglables sur l’onglet Image LUTs. Utilisez l’onglet Courbes pour des ajustements plus fins. Analyse des données (désélection du canal) : Cliquez sur le ruban d’analyse. Pour analyser un seul canal, désélectionnez le canal (s) non analysé. Cliquez sur la vignette Don’t Show Channel d’une chaîne dans les LUTs Image, ne laissant que le canal désiré affiché. Les images importées sous forme de fichiers JPG, PNG ou TIFF peuvent nécessiter la désélection de plusieurs canaux RGB indésirables. Ajout de formes : Pour quantifier l’intensité du signal, cliquez sur Ajouter Rectangle pour ajouter un rectangle à l’image. Cliquez sur le centre d’une fonctionnalité (p. ex., une bande protéique) pour placer un rectangle autour d’elle. Alternativement, pour dessiner manuellement une forme, choisissez Draw Rectangle. Après avoir ajouté toutes les formes souhaitées, cliquez sur Sélectionnez pour retourner le curseur à l’outil de sélection.REMARQUE: Ajoutez plusieurs formes dans un ordre logique, car les données sont triées par un numéro d’ID qui est généré de façon séquentielle. Soustraction de fond : Pour soustraire le bruit de fond, cliquez sur le premier bouton du groupe Contexte et sélectionnez Median dans le menu déroulant. Définir la largeur de la bordure à 3 dans le dialogue d’arrière-plan et sélectionner les segments à utiliser pour le calcul d’arrière-plan. Lorsque vous choisissez les segments à utiliser, sélectionnez les segments qui représentent le mieux l’arrière-plan de l’image.REMARQUE: Le bruit de fond peut affecter la quantification du signal, de sorte qu’il doit être soustrait pour calculer avec précision le signal à partir des formes d’intérêt. Fond de signal et de coupe – OPTIONAL : Les fichiers importés dans les formats JPG, PNG ou TIFF peuvent présenter une saturation de pixels : des régions surlignées/brillantes au sein d’une bande de protéines. Trim Signal et Trim Background (Bkgnd) supprime les pixels saturés de l’analyse. Pour afficher ces valeurs, ajoutez Trim Signal et Trim Bkgnd à une table en cliquant sur le bouton Colonnes à droite de la vue de table.REMARQUE: La saturation des pixels peut conduire à une quantification peu fiable. Les pixels saturés ne peuvent être supprimés que si moins de 5 % des pixels d’une forme sont saturés. Données sur les exportations : Cliquez sur l’onglet Formes au-dessus de la table. Pour la densitométrie, les valeurs dans la colonne Signal sont requises. Le signal est la somme des valeurs d’intensité de pixel (Total) pour une forme moins le produit du Bkgnd et de la zone. Cliquez sur le bouton Rapport. Cliquez sur Enregistrer As ou Lancer feuille de calcul.Signal total (Zone Bkgnd x)REMARQUE: L’onglet formes fournit un tableau de valeurs quantitatives, y compris Signal, Total, Area et Bkgrnd. Quantification de l’expression des protéines : Dans la feuille de calcul enregistrée, calculez l’expression normalisée de la protéine d’intérêt pour chaque voie ou variable en divisant le signal obtenu pour la protéine d’intérêt par le Signal pour la bande de contrôle correspondante de chargement de protéine.REMARQUE: Les comparaisons entre les quantités d’une protéine normalisée d’intérêt entre les fractions nucléaires et cytoplasmiques ne peuvent pas être directement comparées en raison des différents contrôles de chargement utilisés pour distinguer les fractions nucléaires et cytoplasmiques. Cependant, des comparaisons à l’intérieur des fractions individuelles, par exemple après un traitement médicamenteux, sont appropriées. Image d’exportation pour publication ou présentation : Cliquez sur l’onglet Images trouvées au-dessus de la table, puis cliquez sur l’image à exporter. Si vous utilisez l’image pour une présentation de diapositives ou d’autres formats numériques, cliquez sur l’icône logicielle, survolez Export et cliquez sur Image pour les médias numériques. Enregistrez l’image sous forme de fichier JPG, PNG ou TIFF, au besoin.