نظام ميكروانجيكترودي لضخ المخدرات المشتركة والفيزيولوجيا الكهربية
Summary
ونحن نقدم نظام ميكرونجيكترودي مصممه لفسيولوجيا الكهربائية والتسليم بمساعده من التحقيقات التجريبية (اي نانونسيرس ، ميكروالكترودات) ، مع ضخ المخدرات اختياري. وتقترن علي نطاق واسع المكونات ميكروفلويدريك المتاحة إلى قني التي تحتوي علي المسبار. يتم تضمين بروتوكول خطوه بخطوه للبناء microinjectrode ، مع النتائج خلال ضخ muscimol في قشره المكاك.
Abstract
تم تصميم هذا النظام microinjectrode لضخ المخدرات ، والفيزيولوجيا الكهربية ، والتسليم واسترجاع المسبارات التجريبية ، مثل الأقطاب المجهرية والنانو ، الأمثل للاستخدام المتكرر في مستيقظا ، والكائنات التي تتصرف. يمكن تكوين نظام microinjectrode لأغراض متعددة: (1) ترتيب بسيط من قني لوضع مسبار التجريبية التي من شانها ان تكون غير ذلك هش جدا لاختراق الام الجافية ، (2) ضخ ميكروفلويدريك من المخدرات ، اما بصوره مستقله أو مقترنة بأكله اللحوم التي تحتوي علي مسبار تجريبي (اي القطب المجهري أو نانوسيسور). في هذا البروتوكول نفسر خطوه بخطوه البناء من microinjectrode ، اقترانه إلى مكونات ميكروفلويديك ، وبروتوكول لاستخدام النظام في الجسم المجري. وتسمح المكونات الصغيرة لهذا النظام بتسليم الكميات علي مقياس نانوليتر ، مع الحد الأدنى من الضرر الناتج عن الاختراق. يمكن ان يتم ضخ المخدرات بشكل مستقل أو في وقت واحد مع تحقيقات تجريبية مثل الأقطاب المجهرية أو نانونسيرس في مستيقظا ، يتصرف الحيوانية. تطبيقات هذا النظام تتراوح من قياس اثار المخدرات علي النشاط الكهربائية القشرية والسلوك ، لفهم وظيفة منطقه معينه من القشرة في سياق الأداء السلوكي استنادا إلى المسبار أو نانونسياو القياسات. لإظهار بعض من قدرات هذا النظام ، ونحن نقدم مثالا علي ضخ muscimol لتنشيط عكسها من حقل العين الجبهي (FEF) في ماكاك الريسوس اثناء مهمة ذاكره العمل.
Introduction
وتستخدم علي نطاق واسع الفيزيولوجيا الكهربية وطرق حقن المخدرات في علم الأعصاب لدراسة النشاط العصبي والسلوك, في الجسم الآخر, في القوارض والرئيسيات. وعلي مدي العقود الثلاثة الماضية ، سمحت التحسينات التي أدخلت علي نماذج الإنجاز المبكر بتقنية أكثر دقه واقل توغلا ، والتسجيل المتزامن وحقن المخدرات في مواقع المخ المحددة1،2،3. بالنسبة لرئيسيات علي وجه الخصوص ، القدرة علي تسليم كميات صغيره بدقه مع الحد الأدنى من تلف الانسجه أمر بالغ الاهميه إذا كانت هذه التقنية لاستخدامها لدراسة الوظائف المعرفية المتقدمة التي تتطلب الحيوانية المدربين تدريبا عاليا. وتشمل التطورات الاخيره القياسات الكهربية الفسيولوجية والكيميائية المزمنة بالاقتران مع التحفيز باستخدام المجسات المزروعة4، وتم مؤخرا تجريب التسجيل المشترك وتوصيل المخدرات ميكروفلويدريك في القوارض5. نظام injectrode الموصوفة هنا يسمح التسجيل الكهربي ، والتحفيز ، وتسليم المخدرات بدقه ، وقد تم بالفعل تنفيذها بنجاح في مختبرات متعددة الرئيسيات6،7،8.
ان التوافر المتزايد لأجهزه الاستشعار الحساسة والمتخصصة ، مثل النانو9،10 مع تطبيقات العلوم العصبية ، يتطلب طريقه موثوقه للحصول علي المسبار من خلال الام الجافية دون اتلاف الاجهزه النانويه الهشة أو نصائح القطب المجهري.
قمنا بتصميم نظام ميكرونجيكترودي الذي يتغلب علي التحديات التقنية للجمع بين هذه الطرق باستخدام المكونات المتاحة بسهوله ، والمنخفضة التكلفة ، ويسهل وظيفتين رئيسيتين: ‘ 1 ‘ القدرة علي وضع مسبار تجريبي هش ، مثل القطب المجهري أو نانونسياو ، من خلال الام الجافية والانسجه العصبية ، محمية من اي ضرر. تسمح هذه الوظيفة بوضع المسبار التجريبي في المواقع المستهدفة ، وتسليمه باستخدام الكانولا كدليل من خلال النسيج العصبي. ‘ 2 ‘ القدرة علي استخدام القطب المجهري لاجراء تجارب تجمع بين تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية والتحفيز الكهربائي وحقن المخدرات.
يستخدم نظامنا أنبوب دليل لاختراق الجافية ، جنبا إلى جانب مع قني الذي يعمل علي حد سواء لتسليم المخدرات (عند استخدام نظام الضخ المجهري) ويوفر حماية اضافيه للميكروقطب أو نانوسيسور (سواء عندما يمر من خلال الجافية الانسجه العصبية). هذا النظام يمكن بناؤها بسهوله مع المكونات المتاحة تجاريا علي نطاق واسع ، والتي هي غير مكلفه وسهله للعثور علي. نحن تقليل الضرر اختراق باستخدام قني قطر صغير (القطر الخارجي OD = 235 μm ، القطر الداخلي ID = 108 μm).
هنا نقدم تعليمات خطوه بخطوه لبناء microinjectrode والتكوين من النظام ميكروفلويديك. نحن نشرح الخطوات اللازمة لاستخدام microinjectrode ، اما بشكل مستقل أو بالاقتران مع نظام ميكروفلويدريك لحقن المخدرات. ويمكن تطبيق نهج مماثل مع اي مسبار تجريبي هش ، مثل نانوسينسياو9،10. يمكن ان يكون المسبار الامامي أو الخلفي محملا في الكانولا (اعتمادا علي التصميم) ، سيتم حمايته من التلف عند اختراق الانسجه الجافية والعصبية. نحن نقدم مثال البيانات من تجربه في الجسم الخارجي مع الرئيسيات غير البشرية ، والتي استخدمناها القطب الصغير التنغستن لأداء التحفيز الكهربائي ، وبعد ذلك حقن muscimol في مجال العين الاماميه (FEF) في حين ان الحيوانية أداء الذاكرة الموجهة (MGS) مهمة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تتوفر العديد من الطرق حاليا لتنفيذ التسليم في وقت واحد المخدرات والكهربية. والمقصود من نظامنا ان يكون المرونة التي يمكن استخدامها للتسجيلات اما بشكل مستقل أو بالاشتراك مع حقن المخدرات ، وان يكون القدرة علي وضع بدقه اي مسبار التجريبية الهشة ، مثل نانوسيسور أو ميكروالكترود ، محمية من اي ضرر ، من خلال الام الجافية والانسجه العصبية. يسمح النظام بالتحكم الدقيق في كميات تسريب المخدرات بالعين المجردة (17 nL الدقة المبينة في الدراسات السابقة في مختبرنا3).
هناك أكثر يختص نظامات لضغطه حقنه مع أقطار صغيره12. وتسمح هذه النظم بمواقع تسجيل متعددة ، ولكن الاعداد المعقد للبرامج والاجهزه اللازمة للسيطرة علي النظام يحمل تكاليف اعلي لكل مكون ، ولديه مرونة اقل في التفاعل مع المسبارات التجريبية التي لم يتم تسويقها بعد علي نطاق واسع. وعلاوة علي ذلك ، فان الحقن الخاصة بنا لا تتطلب زرعا مزمنا وتوفر درجه كبيره من المرونة: متوافقة مع المواد البيولوجية لقياس الإشارات الكيميائية والكهربية ، وقادره علي غرس المخدرات أيضا ، مع امكانيه قياس تاثير ضخ المخدرات الموضعية علي هذه الاستجابات.
ويسمح التصميم ببروز المسبار التجريبي بعد اختراق الجافية من أجل تجنب الاضرار التي لحقت بهيكل المسبار. هذه الميزة تسمح لتعدد وظائف الجهاز ، لاختراق الجافية دون المخاطرة بالضرر من اي مسبار التجريبية مثل نانومتر مقياس نانوسينسيرس10. ومع ذلك ، هناك قيود علي طول التي يمكن ان تكون نتوء ، مقيده بعدد من المنعطفات من الطوير ، وتقتصر علي ~ 1 مم للقواعد القياسية. هناك الحد الأدنى من تلف الانسجه نظرا لقطر قني الصغيرة (228 μm).
في التجربة التي أظهرناها ، تم استخدام النظام لأداء التسليم المراقب من muscimol لتعطيل عكسها من FEF ، في وقت واحد مع اما التحفيز الكهربائي أو تسجيل خارج الخلية (الخلايا العصبية واحده ، وإمكانات المجال المحلي) باستخدام الميكروالكترود. هذه التجربة في FEF يتطلب التحفيز المجهري لل FEF لتاكيد ناقلات saccade قبل التعطيل ، وتم غرس المخدرات لدراسة الذاكرة العاملة اثناء التنشيط FEF عكسها. ومن غير المرجح ان التسجيل من نفس الخلايا العصبية واحده معزولة يمكن الحفاظ عليها قبل وبعد حقن المخدرات; ومع ذلك ، تمكنا من تسجيل الإمكانات الميدانية المحلية قبل وبعد التسريب. هنا ، نعرض تجربه تجمع بين الحقن والتسجيل والتحفيز الكهربائي.
بمجرد ان يتم اعدادها ، وطريقه موثوقه جدا وقويه. ومع ذلك ، بسبب هطول الامطار من جزيئات صغيره (علي سبيل المثال ، الملح) داخل أنبوب صغير والموانئ ، مطلوب تنظيف شامل بعد كل تجربه من أجل الحفاظ علي موائع خاليه من العوائق والتسريبات. نظرا لبساطه الدائرة بأكملها ، يمكن استبدال كل مكون بشكل مستقل لسهوله استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
علي الرغم من انه تم التدليل علي هذه الطريقة في منطقه FEF في الرئيسيات غير البشرية ، يمكن تطبيق هذا المبدا علي اي منطقه الدماغ الأخرى حيث الرغبة في الجمع بين التحفيز الكهربائي ، وتسجيل ، وحقن المخدرات المطلوبة ، في الأنواع من حجم القوارض أو أكبر.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة ، ومنح EY026924 و EY014800 (إلى B.N.) ، وهو منحه غير مقيده من البحوث لمنع العمي ، وشركه ، نيويورك ، NY إلى قسم طب العيون والعلوم البصرية ، جامعه من ولاية يوتا ، وأموال البدء المقدمة إلى R.E. من قبل مدرسه هنري صامويل للهندسة وقسم الهندسة الكهربائية في جامعه كاليفورنيا ، ايرفين. ويستند هذا الأسلوب علي تقرير سابق من طريقه مماثله وضعت في مختبر الدكتور Tirin مور, نشرت في نودووست & مور 2011, مجلة أساليب العلوم العصبية. ويشكر المؤلفون الدكتورة كيلسي كلارك علي تعليقاتها علي المخطوطة.
Materials
| 3-port manual valves | LabSmith | Manual 3-Port Selector Valve (MV201-C360) | https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26 |
| Cannulae | Vita Needle Company | 304 Stainless steel tubing, Outer Diameter 228μm, Inner Diameter 165μm | https://www.vitaneedle.com/assets/files/Vita_Needle_Master_Tubing_Gauge_Chart.pdf |
| Cleaving stone | Molex | Cleaving stone 1" x 1" (part No. 1068680064) | Highly recommended to follow method for cleaving capillary tubing: https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf |
| Clorhexidine diacetate | Walmart | Nolvasan solution disinfectant (AAP311) | Used for microfluidic circuit flushing, dissolved at 20 g/L |
| Custom adapter | Custom provider | – | Custom machined adapter to connect microinjectrode to hydraulic microdrive |
| Driver | LabSmith | T7 TORX driver for installing breadboard screws (LS-TORX Driver) | https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25 |
| Epoxy glue | LabSmith | Two-part high-strength epoxy adhesive (LS-EPOXY) for metal and plastic bonding | https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#.XO8t89NKh24 |
| Ferrule | LabSmith | One-Piece Fitting (C360-100) for connecting capillary, thru hole sized for 360μm OD capillary | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24 |
| Ferrule plug | LabSmith | One-Piece Plug (C360-101) for use in any -C360 port | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#.XNYFl9NKh24 |
| Ferrule wrench | LabSmith | 1/8" hex wrench for installing one-piece fittings and plugs (LS-HEX 1/8" Hex Wrench) | https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24 |
| Gastight syringe | Hamilton Company | 500μL gastight syringe model 1750 (81220) and 1mL gastight syringe model 1001 (81320) | https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top |
| Gold pins | Aim-Cambridge | Male gold plated crimp-on connector pin (40-9856M) | https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html |
| Lint-free wipes | Kimberly Clark | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task | Lint-free wipes, used to identify leaks in the system |
| Liquid food color | McCormick & Co. | Water based, black liquid food color (52100581873) | https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color |
| Low viscosity oil | Clearco Products Co. | Pure Silicone Fluid Octamethyltrisiloxane with a viscosity of 1cSt at 25°C (PSF-1cSt) | http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html |
| Luer-Lock connector | LabSmith | Luer-Lock Adapter (C360-300), female fitting for connecting Luer Lock syringe to 360μm capillary tubing | https://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24 |
| Micro drill bits | Grainger | Micro drill bit, 0.23mm (414H85) | https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits |
| Microelectrode | FHC | Metal microelectrode, tungsten with epoxy insulation | https://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes |
| Oil hydraulic micromanipulator | Narishige Group | Oil Hydraulic Micromanipulator with guide tube attached (MO-96) | http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html |
| Polymicro Capillary Tubing | Molex | Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing (TSP150375), Outer Diameter 375µm, Inner Diameter 150µm | https://www.molex.com/webdocs/datasheets/pdf/en-us/1068150024_CAPILLARY_TUBING.pdf |
| Programmable syringe pump | Harvard Apparatus | Standard Infuse/Withdraw Pump, programmable (70-2213) | https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html |
| Ruler | Empire | Stainless steel 6" Stiff ruler (27303) | http://www.empirelevel.com/rulers.php |
| Screw set | LabSmith | Valve mounting screw set (LS-SCREWS .25), thread-forming screws (2-28 x 1/4”) to mount valves to breadboard | https://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24 |
| Standard Breadboard | LabSmith | 4" x 6" platform (LS600), with 0.25" hole spacing for mounting fluid circuit | https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24 |
| Sterile saline (sodium chloride) 0.9%. | Baxter | 0.9% Sodium Chloride sterile | Sterile Intravenous Infusion |
| Sterile syringe filters | Millipore Sigma | MilliporeSigma™ Millex™-GP Sterile Syringe Filters with PES Membrane (SLGPM33RS) | https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rs |
| Stoelting manual microsyringe pump | Stoelting Company | Manual infusion/withdrawal pump (51222) | https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html |
| T-junction | LabSmith | Interconnect tee (C360-203) for combining flow streams, for use with 360μm OD capillary tubing | https://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24 |
References
- Chen, L. T. L., Goffart, L., Sparks, D. L. A simple method for constructing microinjectrodes for reversible inactivation in behaving monkeys. Journal of Neuroscience Methods. 107 (1-2), 81-85 (2001).
- Crist, C. F., Yamasaki, D. S. G., Komatsu, H., Wurtz, R. H. A grid system and a microsyringe for single cell recording. Journal of Neuroscience Methods. 26 (2), 117-122 (1988).
- Noudoost, B., Moore, T. A reliable microinjectrode system for use in behaving monkeys. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 218-223 (2011).
- Zhang, S., et al. Real-time simultaneous recording of electrophysiological activities and dopamine overflow in the deep brain nuclei of a non-human primate with Parkinson’s disease using nano-based microelectrode arrays. Microsystems & Nanoengineering. 4, (2018).
- Altuna, A., et al. SU-8 based microprobes for simultaneous neural depth recording and drug delivery in the brain. Lab on a Chip. 13 (7), 1422-1430 (2013).
- Noudoost, B., Clark, K. L., Moore, T. A Distinct Contribution of the Frontal Eye Field to the Visual Representation of Saccadic Targets. Journal of Neuroscience. 34 (10), 3687-3698 (2014).
- Rajalingham, R., DiCarlo, J. J. Reversible Inactivation of Different Millimeter-Scale Regions of Primate IT Results in Different Patterns of Core Object Recognition Deficits. Neuron. 102 (2), 493 (2019).
- Katz, L. N., Ates, J. L. Y., Pillow, J. W., Huk, A. C. Dissociated functional significance of decision-related activity in the primate dorsal stream. Nature. 535 (7611), 285 (2016).
- Esfandyarpour, R., Esfandyarpour, H., Javanmard, M., Harris, J. S., Davis, R. W. Microneedle biosensor: A method for direct label-free real time protein detection. Sensors and Actuators B-Chemical. 177, 848-855 (2013).
- Esfandyarpour, R., Yang, L., Koochak, Z., Harris, J. S., Davis, R. W. Nanoelectronic three-dimensional (3D) nanotip sensing array for real-time, sensitive, label-free sequence specific detection of nucleic acids. Biomedical Microdevices. 18 (1), (2016).
- Bahmani, Z., Daliri, M. R., Merrikhi, Y., Clark, K., Noudoost, B. Working Memory Enhances Cortical Representations via Spatially Specific Coordination of Spike Times. Neuron. 97 (4), 967-979 (2018).
- Veith, V. K., Quigley, C., Treue, S. A Pressure Injection System for Investigating the Neuropharmacology of Information Processing in Awake Behaving Macaque Monkey Cortex. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
