複合薬物注入と電気生理学のためのマイクロインジェクストローデシステム

実験手順は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用のためのガイドと神経科学ガイドラインと政策のための協会に従いました.実験および行動手順のためのプロトコルは、ユタ大学の動物ケアと使用委員会によって承認されました. 1. 刺激と記録のためのマイクロインジェクドの構築(図1a) カニューレとプローブの長さを測定します(この例ではナノセンサー)。プローブは、カニューレ先端から突出する長さ(プローブ設計に応じて)に約2cmを加えた長さによってカニューレよりも長くなければなりません。 拡大鏡または顕微鏡(約10倍倍)の下で、カニューレにプローブをロードします。可能であれば、プローブの先端を保護するためにバックローディングが望ましいです。注:手動で実行するこの手順は困難です。実際の実験プローブを試す前に、虫眼鏡の下でマイクロ電極を使用して練習することをお勧めします。 カニューレ(プローブを含む)を上部フェルール、T接合、および底面フェルールに通します。 プローブがアタッチメントのない単一のワイヤである場合は、それをカウラにバックロードし、アセンブリを下部フェルールからTジャンクションに挿入します。カニューレの上部(フラットエンド側)は、Tジャンクションの中央に配置する必要がありますが、上部フェルール内には配置しないでください。実験プローブまたはバイオセンサーは、トップフェルールの上部に突出する必要があります。注:カスタムメイドのフェルールは、マイクロドリルビットを使用してフェルールプラグに穴を開け、カニューレをT接合部に締め付けるために必要な直径に基づいて穴の大きさを作ることもできます。 フェルールレンチを使用して、Tジャンクションの上部と下部のフェルールを締めます。締め過ぎないでください。小さなチューブを追加して、トップフェルール内の電極支持体を強化することができます。 プローブの仕様に従って、各プローブ端子(信号、グラウンドなど)に金色のピンをはんだ付けします。 プローブとカニューレの相対位置を調整します。プローブがカニューレから突出している距離を倍率で測定し、上端から手動で調整します(プローブはフェルール内で自由にスライドできます)。 金ピンとトップフェルールの間にエポキシ接着剤を加えて、プローブをフェルールに取り付けます。 上部のフェルールを外して、カニューレ内のプローブを引き込みます。プローブが拡大の下でカニューレ内に完全に入っていることを視覚的に確認します。 インジェクトローデをマイクロドライブに取り付けます。 2. 薬物注入用マイクロインジェクストローデの構築 (図1b) フェルールを使用して、カニューレの「ノンベブル」またはフラットエンドをT接合部の底部に取り付けます。フェルールレンチを使用して、フェルールを締めます。 標準のフェルールを通してT接合部の上部に小さな毛細管チューブ(〜1.5cm)を取り付けます。フェルールレンチで締めます。 毛細管、T接合、カニューレおよび対応するフェルールを通してマイクロ電極をバックロードします。 電極のバックエンドがキャピラリーチューブの背面から1cm未満に突出し、電極の先端が底面の所望の距離でカニューレから突出していることを確認します。電極位置は上端から手動で調節することができる。 マイクロ電極端子に金ピンはんだ付けする。 金ピンとトップフェルールの間にエポキシ接着剤を加えて、マイクロ電極をフェルールに取り付けます。 上部のフェルールを外して、カニューレ内のプローブを引き込みます。マイクロ電極がカニューレに完全に引き込まれたことを視覚的に確認します。 3. マイクロ流体回路の構築(図2) 安定した表面にブレッドボードを置きます。2 つの 3 方向バルブをブレッドボードの最も長い側面に平行に配置し、1 つのポート (常に開いているポート) を互いに向けて約 6 in にします。ネジを使用して、バルブをブレッドボードに固定します。 バルブの横に定規を配置します(キャピラリーチューブ内の流体の動きを測定および追跡します)。 1:1の低粘度オイルと食品着色(マーカー)の混合物をガスタイトシリンジにロードし、マーカーポンプに入れます。キャピラリーチューブを1つカットし、標準のフェルールとルアーロックコネクタを使用して、入力バルブのポートの1つにシリンジを接続します。これが「マーカーライン」です。 「定規線」の毛細管の短い部分をカットします。標準のフェルールを使用して、バルブの前面ポートに締め付けます。 2つの長いキャピラリーチューブをカットして、出力バルブをマイクロインジェロードに接続し、ドラッグポンプを入力バルブに接続します(標準フェルールを使用)。注:これらの2つの線の長さは、実験的なセットアップに依存し、1つは注入装置から動物に到達するのに十分な長さでなければならない、もう1つはドラッグポンプから入力バルブに到達する必要があります。切断石を使用して毛細管チューブをカットします。 4. マイクロインジェクトをマイクロドライブに取り付ける (図 3) 取り付け前に、マイクロ電極/実験プローブがカニューレに引き込まれていることを確認してください。注:ガイドチューブはマイクロドライブの位置にある必要があります。 カスタムメイドのアダプターをマイクロインジェロードに取り付けます。 マイクロインジェクドをガイドチューブに通してトップロードし、ネジを使用してアダプターに固定します。 マイクロインジェクドがガイドチューブから突出するマイクロドライブ位置(深さ)を測定し、約1cm後退して挿入の準備をします。 マイクロインフュージョン実験では、「脳線」をマイクロインジェクストローデの未使用のT接合開口部に接続します。標準的なフェルールを使用し、フェルールレンチで締めます。 5. マイクロ流体システムのフラッシングと調製 マイクロインジェクトローデを廃棄物ビーカーの上に置きます。 クロルヘキシジン(例えば、ノルバサン;20 g/Lで溶解)を1mLのガス密注射器に入れ、ドラッグポンプに入れます。液体がバルブを通ってバルブラインに向かい、「脳ライン」を出すようにバルブの流れ方向を回します。 低流量(50~200°L/分)を使用してクロルヘキシジンで回路を10分間フラッシュし、手順5.2~5.3を滅菌生理食塩水と空気で繰り返します。注:この段階でリークをチェックすることが重要です。ジャンクションで糸くずのないワイプを穏やかに塗布し、フェルールを通して液体の漏れを明らかにするのに役立ちます。 500°Lのガスタイトな注射器に薬物をロードし、空気を圧縮し、ドラッグポンプに入れます。マイクロインジェクストローデから数滴が流れるまで50μL/分で流れます。 ガイドチューブをクロルヘキシジン(20g/Lで溶解)に15分間浸します。 出力バルブの方向を「フラッシングライン」に向けます。ルーラーラインに色と油の明確なエッジが観察されるまでマーカーポンプを進めます。2つの水溶性材料を混合し、それらの間の鋭いエッジを失わないように、薬物と色の間に常に油があることを確認してください。このオイル/染料ラインの開始位置をマークします(テープまたはマーカーを使用)。 出力バルブの方向を脳線に向けます。 6. 記録または注入実験の実行 注:動物の取り扱い手順は、実験や実験によって異なります。以下のステップは、必要な外科的セットアップと硬を露出させるための準備が行われた後に行われる。実験に続いて、必要なすべての術後のステップは、制度的に承認されたプロトコルに従って実行されなければなりません。 マイクロドライブを記録室に取り付けます。ガイドチューブを下げてデュラを貫通します。注:ガイドチューブは、皮質を損傷しないように、デュラ以上に浸透してはいけません。 マイクロインジェクドを脳内の記録/注射のために部位の約2mm上に下げる。 上部フェルール(突出マイクロ電極/バイオセンサー)を締め、金ピンを記録システムに接続します。マイクロインジェクストローデを標的部位に進め続ける。注:マイクロ電極がカニューレを超えて延びる距離を計算に含めるのを忘れないでください。 注入実験では、手動マイクロシリンジポンプを使用して、オイルのカラムを3分ごとに1cm(~60 nL/分)移動させます。目的のボリュームが注入されたら、出力バルブをフラッシュラインに向かって切り替えます。注:注入される体積は、標的とするモデル種および脳領域に基づいて変化する。流量が速いと神経組織に損傷を与える可能性があります。 実験が完了したら、ガイドチューブ内にマイクロインジェクトを引き込みます(プローブを突き出したままにします)。次に、フラッシュするマイクロドライブを取り外します。ステップ 5.1~5.5の説明に従ってマイクロ流体システムをフラッシュします。をクリックして再利用の準備をします。注:私たちの経験では、マイクロインジェロードは、適切な注意を払えば、いくつかの用途のために持続します。電気生理学的記録の質は注入の機能より速く落ちる。