מערכת microinjectrode לטיפול בתרופות אינפוזיה ואלקטרופיזיולוגיה של התרופה
Summary
אנו מציגים מערכת microinjectrode מיועד אלקטרופיזיולוגיה וסיוע משלוח של בדיקה ניסויית (כלומר, ננוחיישנים, microאלקטרודות), עם עירוי תרופה אופציונלי. רכיבים במיקרופלואידיג זמינים באופן נרחב לצינורית המכילה את הגשוש. פרוטוקול שלב אחר שלב עבור הבנייה microinjectrode הוא כלול, עם תוצאות במהלך עירוי מוסקימול בקליפת מקוק.
Abstract
מערכת microinjectrode זו מיועדת לעירוי תרופות, אלקטרופיזיולוגיה ומסירה ואחזור של בדיקה ניסויית, כגון מיקרואלקטרודות ו ננו-חיישנים, אופטימיזציה לשימוש חוזר ונשנה בחיות מתנהגות. ניתן להגדיר את מערכת microinjectrode למטרות מרובות: (1) הסדר הפשוט של הצינורית למיקום של בדיקה ניסיונית שאחרת יהיה שברירי מדי לחדור את מאטר דורא, (2) אינפוזיה מיקרופלואידיג של סם, או באופן עצמאי או משולב לצינורית (כלומר, מיקרואלקטרודה, ננו-חיישן). בפרוטוקול זה אנו מסבירים את הצעד אחר צעד בניית המיקרו-הזרקה, הזיווגים שלה לרכיבי microflu, והפרוטוקול לשימוש במערכת בvivo. רכיבי מיקרופלואידים של מערכת זו מאפשרים משלוח של כרכים על הסולם nanoliter, עם נזק חדירה מינימלי. ניתן לבצע עירוי של סמים באופן עצמאי או בו זמנית עם בדיקה ניסויית כגון מיקרואלקטרודות או ננו-חיישנים בעלי חיים מתנהגים. יישומים של טווח מערכת זו מדידת ההשפעות של תרופה על פעילות החשמל הקורטיקלית והתנהגות, כדי להבין את הפונקציה של אזור מסוים של קליפת המוח בהקשר של ביצועים התנהגותיים מבוסס על מדידות בדיקה או ננוחיישן. כדי להדגים חלק מהיכולות של מערכת זו, אנו מציגים דוגמה של אינפוזיה של מוסמול להפעלה הפיכה של שדה העין החזיתי (FEF) ברזוס קוק במהלך משימת זיכרון עבודה.
Introduction
אלקטרופיזיולוגיה ושיטות הזרקת סמים נמצאים בשימוש נרחב במדעי המוח כדי ללמוד פעילות עצבית והתנהגות, ב vivo, מכרסמים ופרימטים. בשלושת העשורים האחרונים, שיפורים של מודלים הזרקה מוקדם התיר טכניקה מדויקת יותר פולשנית פחות, הקלטה סימולטני והזרקת סמים באתרי המוח הספציפיים1,2,3. עבור פרימטים בפרט, את היכולת לספק באופן מדויק כרכים קטנים עם נזק רקמות מינימלי הוא קריטי אם הטכניקה היא לשמש למחקר של פונקציות קוגניטיביות מתקדמות הדורשות חיות מיומן מאוד. ההתקדמות האחרונה כוללת אלקטרופיזיולוגיה כרונית מדידות כימיות בשילוב עם גירוי באמצעות בדיקה מושתל4, והקלטה משולבת משלוח תרופות microfluidic היתה לאחרונה הנווט מכרסמים5. מערכת הinjectrode המתוארת כאן מאפשרת הקלטה אלקטרופיסיולוגית, גירוי, ומסירת סמים מדויקת, והיא כבר יושמה בהצלחה במעבדות פרימטים מרובים6,7,8.
הזמינות הגוברת של חיישנים עדינים, מיוחדים, כגון ננו חיישנים9,10 עם יישומי מדעי המוח, דורש שיטה אמינה להשגת החללית דרך מאטר דורא מבלי לפגוע התקנים ננו שברירי או טיפים מיקרואלקטרודה.
עיצבנו מערכת microinjectrode הגוברת על האתגרים הטכניים של שילוב שיטות אלה באמצעות רכיבים זמינים ובעלות נמוכה, ומקלה על שתי פונקציות עיקריות: (i) היכולת להציב בדיקה ניסיונית שברירית, כגון מיקרואלקטרודה או ננו-חיישן, דרך מאטר דורא ורקמות עצביות, מוגן מכל נזק. פונקציונליות זו מאפשרת מיקום של הגשוש ניסיוני במיקומים ייעודיים, נמסר באמצעות צינורית כמדריך דרך הרקמה העצבית. (ii) היכולת להשתמש במיקרואלקטרודה לביצוע ניסויים המשלבים הקלטות אלקטרופיזיולוגיה וגירוי חשמלי עם הזרקת סמים.
המערכת שלנו משתמשת בצינור מדריך כדי לחדור את הדורא, יחד עם צינורית הפונקציות הן עבור משלוח התרופה (בעת שימוש במערכת עבור microinfusion) ומספק הגנה נוספת עבור המיקרואלקטרודה או ננוחיישן (הן בעת העברת דרך הדורא ו רקמה עצבית). מערכת זו ניתן לבנות בקלות עם רכיבים רבים זמינים מסחרית, אשר זולים וקל למצוא. אנו מצמצמים את הנזק לחדירה באמצעות צינורית בקוטר קטן (OD בקוטר החיצוני = 235 μm, מזהה הקוטר הפנימי = 108 μm).
כאן אנו מציגים הוראות שלב אחר צעד עבור הבנייה microinjectrode וקביעת התצורה של מערכת microfluאידיc. אנו מסבירים את הצעדים הדרושים לשימוש במיקרו-הזרקה, באופן עצמאי או משולב למערכת המיקרופלואידיג להזרקת סמים. גישה דומה יכולה להיות מיושמת עם כל בדיקה ניסיונית שברירית, כגון ננוחיישן9,10. הגשוש יכול להיות מלפנים או מועמס לתוך הצינורית (בהתאם לעיצוב), והיא תהיה מוגנת מפגיעה כאשר היא חודרת לרקמות השכבה והרקמה העצבית. אנו מספקים נתונים למשל מתוך ניסוי vivo עם פרימטים שאינם אנושיים, שבו השתמשנו מיקרואלקטרודה טונגסטן לבצע גירוי חשמלי, ולאחר מכן הוזרק מוסקימול בשדה העין הקדמית (FEF) בעוד בעלי החיים ביצע זיכרון מונחה saccade (MGS) משימה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מספר שיטות הינן זמינות כעת לביצוע מסירת תרופות בו, אלקטרופיזיולוגיה. המערכת שלנו מיועדת לקבל את הגמישות לשמש הקלטות או באופן עצמאי או בשילוב עם הזרקת סמים, ולקבל את היכולת למקום בדיוק כל בדיקה ניסיונית שברירית, כגון ננוחיישן או מיקרואלקטרודה, מוגן מכל נזק, דרך מאטר דורא רקמה עצבית. המערכת מאפשרת שליטה מדויקת באמצעי העירוי של הסמים בעין בולטת (17 בדיוק המוצג במחקרים קודמים במעבדה3).
יש מערכות מיוחדות יותר להזרקת לחץ עם קטרים קטנים יותר12. מערכות אלה מאפשרות מספר אתרי הקלטה, אך ההתקנה המורכבת של התוכנה והחומרה הנדרשת לשליטה במערכת מבצעת עלויות גבוהות יותר עבור כל אחד מהרכיבים, והיא בעלת גמישות פחותה לממשק עם הבדיקות הנסיוניות שעדיין לא ממוסחר בקנה מידה גדול. יתר על כן, הinjectrode שלנו אינו דורש שתל כרוני ומספק מידה רבה של גמישות: תואם עם חיישנים ביולוגיים למדוד אותות כימיים ואלקטרולוגיים, ומסוגל לספק תרופות גם, עם הפוטנציאל למדוד את ההשפעה של התרופה מקומי חליטות על תגובות אלה.
העיצוב מאפשר למכשיר הניסיוני להיות בליטה לאחר חדירת דורא כדי למנוע נזק למבנה הגשוש. תכונה זו מאפשרת ריבוי פונקציונליות של המכשיר, כדי לחדור את הדורה מבלי לסכן נזק של כל מכשיר ניסיוני כגון ננומטר בקנה מידה של ננו10. עם זאת, יש הגבלה של אורך זה יכול להיות בולט, מוגבל על ידי מספר תורות של ferrule, מוגבל ~ 1 מ”מ עבור ferrule סטנדרטי. יש נזק רקמות מינימלי בשל בקוטר קטן של צינורית (228 μm).
בניסוי שראינו, המערכת שימש לביצוע מסירה מבוקרת של מוסמול עבור הפעלה הפיכה של FEF, בו זמנית עם גירוי חשמלי או הקלטה מסירה (תא עצב יחיד, פוטנציאל שדה מקומי) באמצעות מיקרואלקטרודה. הניסוי הזה ב-FEF דורש מיקרוגירוי של FEF כדי לאשר וקטורים מסוימים לפני ההפעלה, והתרופה היתה מוחדרת ללמוד זיכרון עבודה במהלך ההפעלה הפיכה של FEF. לא סביר כי הקלטה מאותו תא העצב בודד ניתן לשמור לפני ואחרי הזרקת התרופה; עם זאת, הצלחנו להקליט פוטנציאל השדה המקומי לפני ואחרי אינפוזיה. כאן, אנו מציגים ניסוי המשלב הזרקה, הקלטה, וגירוי חשמלי.
ברגע שהיא מוגדרת, השיטה היא מאוד אמינה ואיתנה. עם זאת, בשל משקעים של מולקולות קטנות (למשל, מלח) בתוך צינור קטן ונמלים, שטיפה יסודית נדרש לאחר כל ניסוי כדי לשמור על מיקרופלואידיקה ללא חסימות ודליפות. בשל הפשטות של המעגל כולו, ניתן להחליף כל אחד מהרכיבים באופן עצמאי לפתרון בעיות בקלות.
למרות שהשיטה הוכיחה באזור FEF בפרימטים לא אנושיים, העיקרון יכול להיות מיושם על כל אזור מוח אחר שבו יש שילוב של גירוי חשמלי, הקלטה, הזרקת סמים רצוי, במינים של גודל מכרסם או גדול יותר.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מימון המכון הלאומי לבריאות (NIH), מענקים EY026924 ו EY014800 (כדי B.N.), מענק בלתי מוגבל מן המחקר כדי למנוע עיוורון, Inc., ניו יורק, NY למחלקה לרפואת עיניים ומדעי הראייה, אוניברסיטת של יוטה, וכספי הסטארט-up שסופקו ל-R.E. על ידי בית הספר הנרי סמואלי להנדסה והמחלקה להנדסת חשמל באוניברסיטת קליפורניה, אירווין. שיטה זו מבוססת על דו ח קודם של שיטה דומה שפותחה במעבדה של ד ר טירין מור, שפורסם ב Noudoost & מור 2011, היומן של שיטות מדעי המוח. המחברים מודים לד ר קלסי קלארק על הערותיו בכתב היד.
Materials
| 3-port manual valves | LabSmith | Manual 3-Port Selector Valve (MV201-C360) | https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26 |
| Cannulae | Vita Needle Company | 304 Stainless steel tubing, Outer Diameter 228μm, Inner Diameter 165μm | https://www.vitaneedle.com/assets/files/Vita_Needle_Master_Tubing_Gauge_Chart.pdf |
| Cleaving stone | Molex | Cleaving stone 1" x 1" (part No. 1068680064) | Highly recommended to follow method for cleaving capillary tubing: https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf |
| Clorhexidine diacetate | Walmart | Nolvasan solution disinfectant (AAP311) | Used for microfluidic circuit flushing, dissolved at 20 g/L |
| Custom adapter | Custom provider | – | Custom machined adapter to connect microinjectrode to hydraulic microdrive |
| Driver | LabSmith | T7 TORX driver for installing breadboard screws (LS-TORX Driver) | https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25 |
| Epoxy glue | LabSmith | Two-part high-strength epoxy adhesive (LS-EPOXY) for metal and plastic bonding | https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#.XO8t89NKh24 |
| Ferrule | LabSmith | One-Piece Fitting (C360-100) for connecting capillary, thru hole sized for 360μm OD capillary | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24 |
| Ferrule plug | LabSmith | One-Piece Plug (C360-101) for use in any -C360 port | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#.XNYFl9NKh24 |
| Ferrule wrench | LabSmith | 1/8" hex wrench for installing one-piece fittings and plugs (LS-HEX 1/8" Hex Wrench) | https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24 |
| Gastight syringe | Hamilton Company | 500μL gastight syringe model 1750 (81220) and 1mL gastight syringe model 1001 (81320) | https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top |
| Gold pins | Aim-Cambridge | Male gold plated crimp-on connector pin (40-9856M) | https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html |
| Lint-free wipes | Kimberly Clark | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task | Lint-free wipes, used to identify leaks in the system |
| Liquid food color | McCormick & Co. | Water based, black liquid food color (52100581873) | https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color |
| Low viscosity oil | Clearco Products Co. | Pure Silicone Fluid Octamethyltrisiloxane with a viscosity of 1cSt at 25°C (PSF-1cSt) | http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html |
| Luer-Lock connector | LabSmith | Luer-Lock Adapter (C360-300), female fitting for connecting Luer Lock syringe to 360μm capillary tubing | https://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24 |
| Micro drill bits | Grainger | Micro drill bit, 0.23mm (414H85) | https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits |
| Microelectrode | FHC | Metal microelectrode, tungsten with epoxy insulation | https://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes |
| Oil hydraulic micromanipulator | Narishige Group | Oil Hydraulic Micromanipulator with guide tube attached (MO-96) | http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html |
| Polymicro Capillary Tubing | Molex | Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing (TSP150375), Outer Diameter 375µm, Inner Diameter 150µm | https://www.molex.com/webdocs/datasheets/pdf/en-us/1068150024_CAPILLARY_TUBING.pdf |
| Programmable syringe pump | Harvard Apparatus | Standard Infuse/Withdraw Pump, programmable (70-2213) | https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html |
| Ruler | Empire | Stainless steel 6" Stiff ruler (27303) | http://www.empirelevel.com/rulers.php |
| Screw set | LabSmith | Valve mounting screw set (LS-SCREWS .25), thread-forming screws (2-28 x 1/4”) to mount valves to breadboard | https://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24 |
| Standard Breadboard | LabSmith | 4" x 6" platform (LS600), with 0.25" hole spacing for mounting fluid circuit | https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24 |
| Sterile saline (sodium chloride) 0.9%. | Baxter | 0.9% Sodium Chloride sterile | Sterile Intravenous Infusion |
| Sterile syringe filters | Millipore Sigma | MilliporeSigma™ Millex™-GP Sterile Syringe Filters with PES Membrane (SLGPM33RS) | https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rs |
| Stoelting manual microsyringe pump | Stoelting Company | Manual infusion/withdrawal pump (51222) | https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html |
| T-junction | LabSmith | Interconnect tee (C360-203) for combining flow streams, for use with 360μm OD capillary tubing | https://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24 |
References
- Chen, L. T. L., Goffart, L., Sparks, D. L. A simple method for constructing microinjectrodes for reversible inactivation in behaving monkeys. Journal of Neuroscience Methods. 107 (1-2), 81-85 (2001).
- Crist, C. F., Yamasaki, D. S. G., Komatsu, H., Wurtz, R. H. A grid system and a microsyringe for single cell recording. Journal of Neuroscience Methods. 26 (2), 117-122 (1988).
- Noudoost, B., Moore, T. A reliable microinjectrode system for use in behaving monkeys. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 218-223 (2011).
- Zhang, S., et al. Real-time simultaneous recording of electrophysiological activities and dopamine overflow in the deep brain nuclei of a non-human primate with Parkinson’s disease using nano-based microelectrode arrays. Microsystems & Nanoengineering. 4, (2018).
- Altuna, A., et al. SU-8 based microprobes for simultaneous neural depth recording and drug delivery in the brain. Lab on a Chip. 13 (7), 1422-1430 (2013).
- Noudoost, B., Clark, K. L., Moore, T. A Distinct Contribution of the Frontal Eye Field to the Visual Representation of Saccadic Targets. Journal of Neuroscience. 34 (10), 3687-3698 (2014).
- Rajalingham, R., DiCarlo, J. J. Reversible Inactivation of Different Millimeter-Scale Regions of Primate IT Results in Different Patterns of Core Object Recognition Deficits. Neuron. 102 (2), 493 (2019).
- Katz, L. N., Ates, J. L. Y., Pillow, J. W., Huk, A. C. Dissociated functional significance of decision-related activity in the primate dorsal stream. Nature. 535 (7611), 285 (2016).
- Esfandyarpour, R., Esfandyarpour, H., Javanmard, M., Harris, J. S., Davis, R. W. Microneedle biosensor: A method for direct label-free real time protein detection. Sensors and Actuators B-Chemical. 177, 848-855 (2013).
- Esfandyarpour, R., Yang, L., Koochak, Z., Harris, J. S., Davis, R. W. Nanoelectronic three-dimensional (3D) nanotip sensing array for real-time, sensitive, label-free sequence specific detection of nucleic acids. Biomedical Microdevices. 18 (1), (2016).
- Bahmani, Z., Daliri, M. R., Merrikhi, Y., Clark, K., Noudoost, B. Working Memory Enhances Cortical Representations via Spatially Specific Coordination of Spike Times. Neuron. 97 (4), 967-979 (2018).
- Veith, V. K., Quigley, C., Treue, S. A Pressure Injection System for Investigating the Neuropharmacology of Information Processing in Awake Behaving Macaque Monkey Cortex. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
