Kombine İlaç İnfüzyonu ve Elektrofizyolojisi için Mikroenjekrode Sistemi
Summary
Elektrofizyoloji ve deneysel probların (yani nanosensörler, mikroelektrotlar) isteğe bağlı ilaç infüzyonu için tasarlanmış bir mikroenjekrode sistemi salıyoruz. Yaygın olarak bulunan mikroakışkan bileşenler, sondayı içeren bir kanülle birleştiğinde. Makak korteksindeki mussimol infüzyonu sırasında elde edilen sonuçlarla birlikte mikroenjekrode konstrüksiyonu için adım adım protokol dahildir.
Abstract
Bu mikroenjekrode sistemi ilaç infüzyonu için tasarlanmıştır, elektrofizyoloji, ve teslimat ve deneysel probların alınması, mikroelektrotlar ve nanosensörler gibi, uyanık tekrarlanan kullanım için optimize edilmiş, hayvanlar gibi davranan. Mikroenjekrode sistemi birden fazla amaç için yapılandırılabilir: (1) aksi takdirde dura mater nüfuz etmek için çok kırılgan olurdu deneysel bir prob yerleştirilmesi için kanül basit düzenleme, (2) bir ilacın mikroakışkan infüzyonu, ya bağımsız olarak veya deneysel bir prob (yani, mikroelektrot, nanosensor) içeren bir kanül ile birleştiğinde. Bu protokolde mikroenjekrodenin adım adım yapımını, mikroakışkan bileşenlere bağlantısını ve sistemin in vivo kullanımı için protokolü adım adım açıklıyoruz. Bu sistemin mikroakışkan bileşenleri, minimum penetrasyon hasarı ile nanolitre ölçekte hacimlerin teslimine olanak sağlar. İlaç infüzyonu, uyanık, hayvan gibi davranan mikroelektrotlar veya nanosensörler gibi deneysel problarla bağımsız veya eş zamanlı olarak yapılabilir. Bu sistemin uygulamaları kortikal elektriksel aktivite ve davranış üzerinde bir ilacın etkilerini ölçme, sonda veya nanosensör ölçümleri dayalı davranışsal performans bağlamında korteks belirli bir bölgenin işlevini anlamak için değişir. Bu sistemin bazı yeteneklerini göstermek için, bir çalışma bellek görevi sırasında rhesus makak ön göz alanı (FEF) ters inaktivasyonu için muscimol infüzyon bir örnek salıyoruz.
Introduction
Elektrofizyoloji ve ilaç enjeksiyon yöntemleri nöronbilimde nöronal aktivite ve davranışları incelemek için yaygın olarak kullanılır, in vivo, kemirgenlerde ve primatlarda. Son otuz yıl içinde, erken enjektör modellerinin iyileştirmeler daha hassas ve daha az invaziv tekniği izin, ve belirli beyin sitelerinde eşzamanlı kayıt ve ilaçenjeksiyonu 1,2,3. Özellikle primatlar için, teknik yüksek eğitimli hayvanlar gerektiren gelişmiş bilişsel fonksiyonların çalışması için kullanılacaksa, en az doku hasarı ile tam olarak küçük hacimler teslim yeteneği önemlidir. Son gelişmeler implante problar kullanarak stimülasyon ile birlikte kronik elektrofizyolojik ve kimyasal ölçümler içerir4, ve kombine kayıt ve mikroakışkan ilaç teslimat son zamanlarda kemirgenler pilot olmuştur5. Burada açıklanan enjektör sistemi elektrofizyolojik kayıt, stimülasyon ve hassas ilaç dağıtımı sağlar, ve zaten başarıyla birden fazla primat laboratuvarlarında uygulanmıştır6,7,8.
Nanosensors 9 gibi hassas, özel sensörlerin artan kullanılabilirliği9,10 nörolojik uygulamalar ile, kırılgan nanoölçekli cihazlar veya mikroelektrot ipuçları zarar vermeden dura mater yoluyla prob almak için güvenilir bir yöntem gerektirir.
Bu yöntemleri kolayca kullanılabilir, düşük maliyetli bileşenler kullanarak birleştirmenin teknik zorluklarının üstesinden gelen ve iki ana işlevi kolaylaştıran bir mikroenjekrode sistemi tasarladık: (i) Kırılgan bir deneysel sonda yerleştirme yeteneği, örneğin mikroelektrot veya nanosensör, dura mater ve sinir dokusu aracılığıyla, herhangi bir hasara karşı korunur. Bu işlevsellik, deneysel sondanın hedeflenen yerlere yerleştirilmesine olanak sağlar, kanül nöral dokuda bir rehber olarak kullanılarak teslim edilir. (ii) Elektrofizyoloji kayıtları ve elektriksel stimülasyon ile ilaç enjeksiyonunu birleştiren deneyler yapmak için mikroelektrot kullanma becerisi.
Sistemimiz durayı nüfuz etmek için bir kılavuz tüp kullanır, ilaç teslimatı için hem işlevleri bir kanül ile birlikte (mikro infüzyon için sistem kullanırken) ve mikroelektrot veya nanosensor için ek koruma sağlar (hem dura ve geçerken nöral doku). Bu sistem kolayca ucuz ve bulmak kolay yaygın olarak ticari olarak kullanılabilir bileşenleri ile inşa edilebilir. Küçük çaplı bir kanül (dış çap OD = 235 μm, iç çap KIMLIĞI = 108 μm) kullanarak penetrasyon hasarını en aza indiririz.
Burada mikroenjekrode konstrüksiyon ve mikroakışkan sistemin konfigürasyonu için adım adım talimatlar salıyoruz. Biz mikroenjekton kullanımı için gerekli adımları açıklamak, ya bağımsız ya da ilaç enjeksiyonu için mikroakışkan sistemi ile birleştiğinde. Benzer bir yaklaşım herhangi bir kırılgan deneysel prob ile uygulanabilir, nanosensor gibi9,10. Prob kanüle (tasarıma bağlı olarak) ön veya arkadan yüklenebilir ve dura ve nöral dokuya girerken hasardan korunur. Biz insan olmayan primatlar ile bir in vivo deney örnek veri sağlamak, hangi biz elektrik stimülasyon gerçekleştirmek için bir tungsten mikroelektrot kullanılan, ve daha sonra ön göz alanında mussimol enjekte (FEF) hayvan bir bellek güdümlü saccade (MGS) görev gerçekleştirirken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çeşitli yöntemler şu anda eşzamanlı ilaç teslimat ve elektrofizyoloji gerçekleştirmek için kullanılabilir. Sistemimiz, kayıtlarda bağımsız olarak veya ilaç enjeksiyonu ile birlikte kullanılabilme esnekliğine sahip olmak ve dura mater ve nöral doku yoluyla herhangi bir hasardan korunan nanosensör veya mikroelektrot gibi kırılgan deneysel probu tam olarak yerleştirme yeteneğine sahip olmak için tasarlanmıştır. Sistem çıplak gözle ilaç infüzyon hacimlerinin hassas kontrolünü sağlar (laboratuarımızda önceki çalışmalarda gösterilen 17 nLhassasiyeti 3).
Daha küçük çaplarda basınç enjeksiyonu için daha özel sistemler vardır12. Bu sistemler birden fazla kayıt sitesi için izin verir, ancak sistemin kontrolü için gerekli yazılım ve donanımkarmaşık kurulum bileşenlerinin her biri için daha yüksek maliyetler taşır ve henüz büyük bir ölçekte ticari olmayan deneysel problar ile arayüz için daha az esnekliğe sahiptir. Ayrıca, bizim enjektör kronik bir implant gerektirmez ve esneklik büyük ölçüde sağlar: kimyasal ve elektrofizyolojik sinyalleri ölçmek için biyosensörler ile uyumlu, ve de ilaç aşılama yeteneğine sahip, bu yanıtlar lokalize ilaç infüzyon etkisini ölçmek için potansiyel.
Tasarım, probun yapısına zarar vermemek için deneysel probun dura penetrasyonundan sonra çıkıntılı olmasını sağlar. Bu özellik cihazın çok işlevsellik sağlar, nanometre ölçekli nanosensors10gibi herhangi bir deneysel prob zarar riski olmadan dura nüfuz etmek. Ancak, standart ferrules için ~ 1 mm ile sınırlı, ferrule dönüş sayısı ile sınırlı, çıkıntılı olabilir uzunluğu bir sınırlama vardır. Küçük kanül çapına bağlı olarak en az doku hasarı vardır (228 μm).
Gösterdiğimiz deneyde, sistem FEF’nin geri dönüşümlü inaktivasyonu için müsimolün kontrollü teslimatını gerçekleştirmek için kullanıldı, aynı anda elektriksel stimülasyon veya hücre dışı kayıt (tek nöron, yerel alan potansiyeli) kullanılarak mikro elektrot. FEF’deki bu deney, inaktivasyondan önce saccade vektörlerini doğrulamak için FEF’nin mikrostimülasyonu gerektirir ve ilaç geri dönüşümlü FEF inaktivasyonu sırasında çalışma belleği üzerinde çalışmak için aşılandı. Bu aynı izole tek nöron bir kayıt önce ve ilaç enjeksiyonu sonra muhafaza edilebilir olası değildir; ancak, infüzyon öncesi ve sonrası yerel alan potansiyellerini kaydetmeyi başardık. Burada enjeksiyon, kayıt ve elektriksel stimülasyonun biraraya geldiği bir deney gösteriyoruz.
Kurulduktan sonra, yöntem çok güvenilir ve sağlamdır. Ancak, küçük tüp ve portlar içinde küçük moleküllerin (örneğin, tuz) yağış nedeniyle, mikroakışkanların tıkanıklık ve sızıntılardan uzak tutmak için her deneyden sonra iyice temizlenmesi gerekir. Tüm devrenin basitliği sayesinde, her bileşen kolay sorun giderme için bağımsız olarak değiştirilebilir.
Yöntem insan olmayan bir primat FEF alanında gösterilmiştir rağmen, ilke kemirgen boyutu veya daha büyük türlerde, elektrikstimülasyon, kayıt ve ilaç enjeksiyonu bazı kombinasyonu istenen başka bir beyin alanına uygulanabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH), EY026924 ve EY014800 (B.N.), Körlüğü Önlemek Için Araştırma, Inc. New York, NY Oftalmoloji ve Görsel Bilimler Bölümü’ne sınırsız hibe hibe finansmanı ile desteklenmiştir, Üniversite Utah ve Henry Samueli Mühendislik Okulu ve California Üniversitesi Elektrik Mühendisliği Bölümü, Irvine tarafından R.E. sağlanan başlangıç fonları. Bu yöntem, Dr Tirin Moore’un laboratuvarında geliştirilen benzer bir yöntemin önceki raporuna dayanmaktadır, Noudoost & Moore 2011, Journal of Neuroscience Methods’de yayınlanmıştır. Yazarlar, dr. Kelsey Clark’a el yazması hakkındaki yorumları için teşekkür eder.
Materials
| 3-port manual valves | LabSmith | Manual 3-Port Selector Valve (MV201-C360) | https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26 |
| Cannulae | Vita Needle Company | 304 Stainless steel tubing, Outer Diameter 228μm, Inner Diameter 165μm | https://www.vitaneedle.com/assets/files/Vita_Needle_Master_Tubing_Gauge_Chart.pdf |
| Cleaving stone | Molex | Cleaving stone 1" x 1" (part No. 1068680064) | Highly recommended to follow method for cleaving capillary tubing: https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf |
| Clorhexidine diacetate | Walmart | Nolvasan solution disinfectant (AAP311) | Used for microfluidic circuit flushing, dissolved at 20 g/L |
| Custom adapter | Custom provider | – | Custom machined adapter to connect microinjectrode to hydraulic microdrive |
| Driver | LabSmith | T7 TORX driver for installing breadboard screws (LS-TORX Driver) | https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25 |
| Epoxy glue | LabSmith | Two-part high-strength epoxy adhesive (LS-EPOXY) for metal and plastic bonding | https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#.XO8t89NKh24 |
| Ferrule | LabSmith | One-Piece Fitting (C360-100) for connecting capillary, thru hole sized for 360μm OD capillary | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24 |
| Ferrule plug | LabSmith | One-Piece Plug (C360-101) for use in any -C360 port | https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#.XNYFl9NKh24 |
| Ferrule wrench | LabSmith | 1/8" hex wrench for installing one-piece fittings and plugs (LS-HEX 1/8" Hex Wrench) | https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24 |
| Gastight syringe | Hamilton Company | 500μL gastight syringe model 1750 (81220) and 1mL gastight syringe model 1001 (81320) | https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top |
| Gold pins | Aim-Cambridge | Male gold plated crimp-on connector pin (40-9856M) | https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html |
| Lint-free wipes | Kimberly Clark | Kimtech Science Kimwipes Delicate Task | Lint-free wipes, used to identify leaks in the system |
| Liquid food color | McCormick & Co. | Water based, black liquid food color (52100581873) | https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color |
| Low viscosity oil | Clearco Products Co. | Pure Silicone Fluid Octamethyltrisiloxane with a viscosity of 1cSt at 25°C (PSF-1cSt) | http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html |
| Luer-Lock connector | LabSmith | Luer-Lock Adapter (C360-300), female fitting for connecting Luer Lock syringe to 360μm capillary tubing | https://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24 |
| Micro drill bits | Grainger | Micro drill bit, 0.23mm (414H85) | https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits |
| Microelectrode | FHC | Metal microelectrode, tungsten with epoxy insulation | https://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes |
| Oil hydraulic micromanipulator | Narishige Group | Oil Hydraulic Micromanipulator with guide tube attached (MO-96) | http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html |
| Polymicro Capillary Tubing | Molex | Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing (TSP150375), Outer Diameter 375µm, Inner Diameter 150µm | https://www.molex.com/webdocs/datasheets/pdf/en-us/1068150024_CAPILLARY_TUBING.pdf |
| Programmable syringe pump | Harvard Apparatus | Standard Infuse/Withdraw Pump, programmable (70-2213) | https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html |
| Ruler | Empire | Stainless steel 6" Stiff ruler (27303) | http://www.empirelevel.com/rulers.php |
| Screw set | LabSmith | Valve mounting screw set (LS-SCREWS .25), thread-forming screws (2-28 x 1/4”) to mount valves to breadboard | https://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24 |
| Standard Breadboard | LabSmith | 4" x 6" platform (LS600), with 0.25" hole spacing for mounting fluid circuit | https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24 |
| Sterile saline (sodium chloride) 0.9%. | Baxter | 0.9% Sodium Chloride sterile | Sterile Intravenous Infusion |
| Sterile syringe filters | Millipore Sigma | MilliporeSigma™ Millex™-GP Sterile Syringe Filters with PES Membrane (SLGPM33RS) | https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rs |
| Stoelting manual microsyringe pump | Stoelting Company | Manual infusion/withdrawal pump (51222) | https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html |
| T-junction | LabSmith | Interconnect tee (C360-203) for combining flow streams, for use with 360μm OD capillary tubing | https://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24 |
References
- Chen, L. T. L., Goffart, L., Sparks, D. L. A simple method for constructing microinjectrodes for reversible inactivation in behaving monkeys. Journal of Neuroscience Methods. 107 (1-2), 81-85 (2001).
- Crist, C. F., Yamasaki, D. S. G., Komatsu, H., Wurtz, R. H. A grid system and a microsyringe for single cell recording. Journal of Neuroscience Methods. 26 (2), 117-122 (1988).
- Noudoost, B., Moore, T. A reliable microinjectrode system for use in behaving monkeys. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 218-223 (2011).
- Zhang, S., et al. Real-time simultaneous recording of electrophysiological activities and dopamine overflow in the deep brain nuclei of a non-human primate with Parkinson’s disease using nano-based microelectrode arrays. Microsystems & Nanoengineering. 4, (2018).
- Altuna, A., et al. SU-8 based microprobes for simultaneous neural depth recording and drug delivery in the brain. Lab on a Chip. 13 (7), 1422-1430 (2013).
- Noudoost, B., Clark, K. L., Moore, T. A Distinct Contribution of the Frontal Eye Field to the Visual Representation of Saccadic Targets. Journal of Neuroscience. 34 (10), 3687-3698 (2014).
- Rajalingham, R., DiCarlo, J. J. Reversible Inactivation of Different Millimeter-Scale Regions of Primate IT Results in Different Patterns of Core Object Recognition Deficits. Neuron. 102 (2), 493 (2019).
- Katz, L. N., Ates, J. L. Y., Pillow, J. W., Huk, A. C. Dissociated functional significance of decision-related activity in the primate dorsal stream. Nature. 535 (7611), 285 (2016).
- Esfandyarpour, R., Esfandyarpour, H., Javanmard, M., Harris, J. S., Davis, R. W. Microneedle biosensor: A method for direct label-free real time protein detection. Sensors and Actuators B-Chemical. 177, 848-855 (2013).
- Esfandyarpour, R., Yang, L., Koochak, Z., Harris, J. S., Davis, R. W. Nanoelectronic three-dimensional (3D) nanotip sensing array for real-time, sensitive, label-free sequence specific detection of nucleic acids. Biomedical Microdevices. 18 (1), (2016).
- Bahmani, Z., Daliri, M. R., Merrikhi, Y., Clark, K., Noudoost, B. Working Memory Enhances Cortical Representations via Spatially Specific Coordination of Spike Times. Neuron. 97 (4), 967-979 (2018).
- Veith, V. K., Quigley, C., Treue, S. A Pressure Injection System for Investigating the Neuropharmacology of Information Processing in Awake Behaving Macaque Monkey Cortex. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
