Hematopoetik Kök Atasının Hücre Metabolizmasının Analizi
Summary
Hematopoetik kök ata hücreleri (HSPCs) kan oluşumu sırasında metabolik plastisite nedeniyle bir farklılaşma durumuna quiescent devlet geçiş. Burada, HSPC’lerin mitokondriyal solunumunu ve glikolizini ölçmek için optimize edilmiş bir yöntem salıyoruz.
Abstract
Hematopoetik kök ata hücreleri (HSPCs) farklı metabolik plastisite var, hangi onları kan oluşumu taleplerini sürdürmek için bir farklılaşma durumuna quiescent devlet geçiş sağlar. Ancak, sınırlı sayıda ve non-adherent, kırılgan HSPCs için optimize protokollerin eksikliği nedeniyle HSPCs metabolik durumunu (mitokondriyal solunum ve glikoliz) analiz etmek zor olmuştur. Burada, metabolik solunumu (oksijen tüketim oranı) ölçmek için bir dizi açık, adım adım talimatlar salıyoruz; OCR) ve glikoli (ekstrasellüler asitleşme hızı; ECAR) murine kemik iliği-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. Bu protokol, murin kemik iliğinden daha yüksek miktarda LSK HSPC sağlar, kuluçka sırasında HSPC’lerin canlılığını artırır, non-yapışık HSPC’lerin hücre dışı akı analizlerini kolaylaştırır ve oksidatif fosforilasyon ve glikolitik yolları hedefleyen ilaçlar için optimize edilmiş enjeksiyon protokolleri (konsantrasyon ve zaman) sağlar. Bu yöntem, kan gelişimi ve hastalıkları sırasında hspcs metabolik durum ve sağlık tahmin sağlar.
Introduction
En olgun kan hücrelerinin ömrü kısa olduğundan, kan homeostazı kendini yenileme ve hematopoetik kök hücrelerin uzun ömürlü ama nadir popülasyonun farklılaşması dayanır (HSPCs)1. HSPCs quiescent, ancak çoğalmak için hızlı ve kan sisteminin taleplerini sürdürmek için uyarılma üzerine farklılaşma uğrar. Her HSPC hücresel devlet benzersiz bir biyoenerjik talep gerektirir gibi, metabolik değişiklikler HSPC kader kararlarının önemli sürücüleri vardır. Bu nedenle, metabolik plastisite kaybı, quiescence arasındaki dengeyi değiştirerek, kendini yenileme, ve HSPCs farklılaşması, genellikle miyelo yol açar- veya lenfo-proliferatif bozukluklar. Birlikte, HSPC gelişiminin metabolik regülasyon anlayışı hematolojik maligniteler2,3,4,5altında yatan mekanizmaları ortaya çıkarmak için önemlidir.
Mitokondriyal solunum ve glikoliz hücre içi reaksiyonları yönlendirmek ve makromolekül sentezi için gerekli yapı taşlarını üretmek için ATP üretir. HSPC’ler farklılaşmışhücreler6 ile karşılaştırıldığında düşük mitokondriyal kütleye sahip olduğundan ve hipoksik kemik iliği nişlerinde quiescence sürdürmek, HSPCs öncelikle glikoliz güveniyor. HSPCs aktivasyonu quiescence kaybı ve hücre döngüsüne sonraki giriş yol açan onların mitokondriyal metabolizmageliştirir. HSPCs bu tür metabolik plastisite yetişkinyaşam6,7,8,9,10,11,12boyunca HSPC havuzunun bakım sağlar. Bu nedenle, HSPC aktivasyonunu ve sağlık durumunu analiz etmek için oksijen tüketim hızı (OCR; oksidatif fosforilasyon indeksi) ve hücre dışı asitleşme oranı (ECAR; glikoliz indeksi) gibi metabolik aktivitelerinin araştırılması önemlidir. Hem OCR hem de ECAR, hücre dışı akı analizörü kullanılarak gerçek zamanlı olarak aynı anda ölçülebilir. Ancak, geçerli yöntem çok sayıda hücre gerektirir ve yapışık hücreler için optimize edilir13. HSPCs fareler den büyük miktarlarda izole edilemez olduğundan14, saf bir popülasyon elde etmek için sıralama gerektiren, non-yapışık hücreler15, ve farklılaşma kaçınarak olmadan bir gecede kültürolamaz16, OCR ve HSPCs ECAR ölçmek zor olmuştur. Burada, metabolik solunum ve birkaç bin murin kemik iliği-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs glikoliz ölçmek için nasıl video tabanlı öğreticiler eşlik etmek için net, adım adım talimatlar bir dizi sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, maksimum miktarda saf ve uygun murine LSK HSPC popülasyonunun izolasyonunu ve glikoliz ve mitokondriyal solunumölçümlerini hücre dışı akı analizörü ile gösteriyoruz. Özellikle, protokol LSK HSPCs kullanımı için aşağıdaki teknik sorunları aşar : i) mürin kemik iliği LSK HSPCs düşük frekanslı14, ii) LSK HSPCs düşük bazal metabolik aktivite26, iii) LSK HSPCs27kırılganlığı , ve iv) LSK HSPCs eksikliği<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (HL131645, CA016058), St. Baldrick Vakfı ve Pelotonia Vakfı’nın finansman desteği ile desteklenmiştir.
Materials
| 0.01% (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | Used for LSK attachment |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used for cell filtration after bone crushing |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi | 130-090-485 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 | BD Biosciences | 553672 | Used for Lin- separation |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | Used for LSK sorting |
| Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | Used for LSK sorting |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001-HI | Used in FACS buffer |
| Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | Used for ficoll gradient separation |
| L-glutamine 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | Used for the assay media |
| LS Column | Miltenyi | 130-042-401 | Used for Lin- separation |
| Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5981-82 | Used for LSK sorting |
| Murine Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | Used for the assay media |
| Murine Thrombopoietin (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | Used for the assay media |
| PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | Used for FACS buffer |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | Used for the assay media |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | P1304MP | Used for LSK sorting |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 | Used for LSK seeding |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher | 11360070 | Used for the assay media |
| Streptavidin eFluor 450 Conjugate | eBioscience | 48-4317-82 | Used for LSK sorting |
| XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | Used for cartridge equilibration |
| XF media | Agilent Technologies | 103575-100 | Used for the assay media |
| XFp Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103017100 | Drugs for glycolysis stress test |
| XFp Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103010100 | Drugs for mitochondrial stress test |
| XFp Sensor Cartridge | Agilent Technologies | 103022-100 | Used for glycolysis and mitochondrial stress test |
References
- Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
- Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).
- Kohli, L., Passegue, E. Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells. Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).
- Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. Metabolism and the leukemic stem cell. The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).
- Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communication. 7, 13125 (2016).
- Anso, E., et al. The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function. Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).
- Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate. Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).
- Maryanovich, M., et al. An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate. Nature Communication. 6, 7901 (2015).
- Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche. Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).
- Zhang, C. C., Sadek, H. A. Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells. Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).
- Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).
- Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).
- Jung, Y., et al. Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche. Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).
- Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Niche-less maintenance of HSCs by 2i. Cell Research. 23, 458-459 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126, 2811-2820 (2015).
- Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).
- Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last. EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).
- Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies. Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).
- Halestrap, A. P., Wilson, M. C. The monocarboxylate transporter family–role and regulation. IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).
- Kim, A. Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders. Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).
- Fosslien, E. Mitochondrial medicine–molecular pathology of defective oxidative phosphorylation. Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).
- Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose. The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).
- Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthetase systems. Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).
- Rimmele, P., et al. Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3. EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).
- Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads. Blood. 119, 1107-1116 (2012).
- Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
