Análisis del metabolismo de células hematopoyéticas del progenitor del tallo
Summary
Células progenitoras hematopoyéticas (HSPC) transición de un estado de reposo a un estado de diferenciación debido a su plasticidad metabólica durante la formación de sangre. Aquí, presentamos un método optimizado para medir la respiración mitocondrial y la glucólisis de los HSCCP.
Abstract
Las células progenitoras hematopoyéticas del tallo (HSpC) tienen una plasticidad metabólica distinta, lo que les permite pasar de su estado de reposo a un estado de diferenciación para sostener las demandas de la formación de sangre. Sin embargo, ha sido difícil analizar el estado metabólico (respiración mitocondrial y glucólisis) de los HSCCP debido a su número limitado y la falta de protocolos optimizados para los HSCCP no adherentes y frágiles. Aquí, proporcionamos un conjunto de instrucciones claras, paso a paso para medir la respiración metabólica (tasa de consumo de oxígeno; OCR) y glicólisis (tasa de acidificación extracelular; ECAR) de la médula ósea murina-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. Este protocolo proporciona una mayor cantidad de HSCCP LSK de la médula ósea murina, mejora la viabilidad de los HSCCP durante la incubación, facilita los análisis de flujo extracelular de los HSCCP no adherentes y proporciona protocolos de inyección optimizados (concentración y tiempo) para fármacos dirigidos a la fosforilación oxidativa y vías glucolíticas. Este método permite la predicción del estado metabólico y la salud de los HSCCP durante el desarrollo de la sangre y enfermedades.
Introduction
Dado que la vida útil de la mayoría de las células sanguíneas maduras es corta, la homeostasis de la sangre se basa en la auto-renovación y diferenciación de una población larga pero rara de células madre hematopoyéticas (HSCCP)1. Los HSCCP están en reposo, pero son rápidos para proliferar y se someten a una diferenciación al ser estimulación para sostener las demandas del sistema sanguíneo. Como cada estado celular hSPC requiere una demanda bioenergética única, los cambios metabólicos son factores clave de las decisiones del destino de HSPC. Por lo tanto, la pérdida de plasticidad metabólica, al alterar el equilibrio entre la reposo, la auto-renovación y la diferenciación de los HSCCP, a menudo conduce a trastornos mielo-o linfo-proliferativos. Juntos, la comprensión de la regulación metabólica del desarrollo de la HSPC es fundamental para descubrir mecanismos subyacentes a las neoplasias malignas hematológicas2,3,4,5.
La respiración mitocondrial y la glucólisis generan ATP para impulsar las reacciones intracelulares y producir los bloques de construcción necesarios para la síntesis de macromoléculas. Dado que los HSCCP tienen una masa mitocondrial baja en comparación con las células diferenciadas6 y sostienen la reposo en nichos hipoxicos de médula ósea, los HSCCP dependen principalmente de la glucólisis. La activación de los HSCCP mejora su metabolismo mitocondrial que conduce a la pérdida de reposo y su posterior entrada en el ciclo celular. Dicha plasticidad metabólica de hSCCP permite el mantenimiento de la piscina HSPC a lo largo de la vida adulta6,7,8,9,10,11,12. Por lo tanto, es fundamental investigar sus actividades metabólicas, como la tasa de consumo de oxígeno (OCR; índice de fosforilación oxidativa) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR; índice de glucólisis) para analizar la activación de la HSPC y el estado de salud. Tanto el OCR como el ECAR se pueden medir simultáneamente, en tiempo real, utilizando un analizador de flujo extracelular. Sin embargo, el método actual requiere un gran número de celdas y está optimizado para las celdas adherentes13. Dado que los HSCCP no se pueden aislar en grandes cantidades de ratones14,requieren clasificación para obtener una población pura, son células no adherentes15,y no se pueden cultivar durante la noche sin evitar la diferenciación16,ha sido difícil medir el OCR y el ECAR de HSCCP. Aquí, proporcionamos un conjunto de instrucciones claras, paso a paso para acompañar tutoriales basados en vídeo sobre cómo medir la respiración metabólica y glucólisis de pocos miles de miles de médula ósea murinos-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, demostramos el aislamiento de una cantidad máxima de población de HSCC LSK murinos puros y viables, así como la medición de su glucólisis y respiración mitocondrial con un analizador de flujo extracelular. Específicamente, el protocolo supera los siguientes problemas técnicos para el uso de HSCCP LSK : i) la baja frecuencia de HSCCP LSK en médula ósea murina14, ii) actividad metabólica basal baja de LSK HSCCP26, iii) la fragilidad de LSK HSCCP<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo está en parte respaldado por el apoyo de financiación de los Institutos Nacionales de Salud (HL131645, CA016058), la Fundación St. Baldrick y la Fundación Pelotonia.
Materials
| 0.01% (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | Used for LSK attachment |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used for cell filtration after bone crushing |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi | 130-090-485 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 | BD Biosciences | 553672 | Used for Lin- separation |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | Used for LSK sorting |
| Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | Used for LSK sorting |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001-HI | Used in FACS buffer |
| Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | Used for ficoll gradient separation |
| L-glutamine 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | Used for the assay media |
| LS Column | Miltenyi | 130-042-401 | Used for Lin- separation |
| Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5981-82 | Used for LSK sorting |
| Murine Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | Used for the assay media |
| Murine Thrombopoietin (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | Used for the assay media |
| PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | Used for FACS buffer |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | Used for the assay media |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | P1304MP | Used for LSK sorting |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 | Used for LSK seeding |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher | 11360070 | Used for the assay media |
| Streptavidin eFluor 450 Conjugate | eBioscience | 48-4317-82 | Used for LSK sorting |
| XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | Used for cartridge equilibration |
| XF media | Agilent Technologies | 103575-100 | Used for the assay media |
| XFp Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103017100 | Drugs for glycolysis stress test |
| XFp Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103010100 | Drugs for mitochondrial stress test |
| XFp Sensor Cartridge | Agilent Technologies | 103022-100 | Used for glycolysis and mitochondrial stress test |
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