Analyse du métabolisme hématopoïétique des cellules progénitrices
Summary
Les cellules progénitrices de tige hématopoïétiques (HSPc) transition d’un état quiescent à un état de différenciation dû à leur plasticité métabolique pendant la formation de sang. Ici, nous présentons une méthode optimisée pour mesurer la respiration mitochondriale et la glycolyse des HSPC.
Abstract
Les cellules hématopoïétiques progénitrices de tige (HSPc) ont la plasticité métabolique distincte, qui leur permet de passer de leur état quiescent à un état de différenciation pour soutenir des demandes de la formation de sang. Cependant, il a été difficile d’analyser l’état métabolique (respiration mitochondriale et glycolyse) des HSPC en raison de leur nombre limité et de l’absence de protocoles optimisés pour les HSPC fragiles et non adhérents. Ici, nous fournissons un ensemble d’instructions claires, étape par étape pour mesurer la respiration métabolique (taux de consommation d’oxygène; OCR) et la glycolyse (taux d’acidification extracellulaire; ECAR) de la moelle osseuse murine-Lineageneg Sca1c-Kit(LSK) HSPc. Ce protocole fournit une plus grande quantité de HSPC LSK de la moelle osseuse, améliore la viabilité des HSPC pendant l’incubation, facilite les analyses de flux extracellulaires des HSPC non adhérents, et fournit des protocoles d’injection optimisés (concentration et temps) pour les médicaments ciblant la phosphorylation oxydative et les voies glycolytiques. Cette méthode permet de prédire l’état métabolique et la santé des HSPC pendant le développement sanguin et les maladies.
Introduction
Puisque la durée de vie de la plupart des cellules sanguines matures est courte, l’homéostasie du sang repose sur l’auto-renouvellement et la différenciation d’une population de longue durée mais rare de cellules souches hématopoïétiques (HSPC)1. Les HSPC sont tranquilles, mais ils sont prompts à proliférer et à subir une différenciation à la stimulation pour soutenir les exigences du système sanguin. Comme chaque état cellulaire HSPC nécessite une demande bioénergétique unique, les changements métaboliques sont des moteurs clés des décisions de destin HSPC. Par conséquent, la perte de plasticité métabolique, en modifiant l’équilibre entre la quiescence, l’auto-renouvellement et la différenciation des HSPC, conduit souvent à des troubles myéloou ou lympho-proliférants. Ensemble, la compréhension de la régulation métabolique du développement HSPC est essentielle pour découvrir les mécanismes sous-jacents aux malignités hématologiques2,3,4,5.
La respiration mitochondriale et la glycolyse génèrent de l’ATP pour susciter des réactions intracellulaires et produire les éléments constitutifs nécessaires à la synthèse des macromolécules. Puisque les HSPC ont la basse masse mitochondrique comparée aux cellules différenciées6 et ils soutiennent la quiescence dans les niches hypoxiques de moelle, Les HSPC s’appuient principalement sur la glycolyse. L’activation des HSPC améliore leur métabolisme mitochondrial qui mène à la perte de quiescence et à leur entrée ultérieure dans le cycle cellulaire. Une telle plasticité métabolique des HSPC permet le maintien de la piscine HSPC tout au long de la vie adulte6,7,8,9,10,11,12. Par conséquent, il est essentiel d’étudier leurs activités métaboliques, telles que le taux de consommation d’oxygène (OCR; indice de phosphorylation oxydative) et le taux d’acidification extracellulaire (ECAR; indice de glycolyse) pour analyser l’activation du HSPC et l’état de santé. L’OCR et l’ECAR peuvent être mesurés simultanément, en temps réel, à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire. Cependant, la méthode actuelle nécessite un grand nombre de cellules et est optimisée pour les cellules adhérentes13. Étant donné que les HSPC ne peuvent pas être isolés en grandes quantités de souris14, nécessitent le tri pour obtenir une population pure, sont des cellules non adhérentes15, et ne peuvent pas être cultivés du jour au lendemain sans éviter la différenciation16, il a été difficile de mesurer l’OCR et l’ECAR des HSPC. Ici, nous fournissons un ensemble d’instructions claires, étape par étape pour accompagner des tutoriels vidéo sur la façon de mesurer la respiration métabolique et la glycolyse de quelques milliers de moelle osseusemurine-Lineage negSca1–c-Kit (LSK) HSPCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous démontrons l’isolement d’une quantité maximale de population pure et viable de HSPCs murine aussi bien que la mesure de leur glycolyse et respiration mitochondriale avec un analyseur extracellulaire de flux. Plus précisément, le protocole surmonte les problèmes techniques suivants pour l’utilisation des HSPC LSK : i) la basse fréquence des HSPC LSK dans la moelle osseuse murine14, ii) faible activité métabolique basale de LSK HSPCs26, iii) la fragilité de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est en partie soutenu par le soutien financier des National Institutes of Health (HL131645, CA016058), de la Fondation St. Baldrick’s et de la Fondation Pelotonia.
Materials
| 0.01% (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | Used for LSK attachment |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used for cell filtration after bone crushing |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi | 130-090-485 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 | BD Biosciences | 553672 | Used for Lin- separation |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | Used for LSK sorting |
| Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | Used for LSK sorting |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001-HI | Used in FACS buffer |
| Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | Used for ficoll gradient separation |
| L-glutamine 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | Used for the assay media |
| LS Column | Miltenyi | 130-042-401 | Used for Lin- separation |
| Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5981-82 | Used for LSK sorting |
| Murine Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | Used for the assay media |
| Murine Thrombopoietin (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | Used for the assay media |
| PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | Used for FACS buffer |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | Used for the assay media |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | P1304MP | Used for LSK sorting |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 | Used for LSK seeding |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher | 11360070 | Used for the assay media |
| Streptavidin eFluor 450 Conjugate | eBioscience | 48-4317-82 | Used for LSK sorting |
| XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | Used for cartridge equilibration |
| XF media | Agilent Technologies | 103575-100 | Used for the assay media |
| XFp Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103017100 | Drugs for glycolysis stress test |
| XFp Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103010100 | Drugs for mitochondrial stress test |
| XFp Sensor Cartridge | Agilent Technologies | 103022-100 | Used for glycolysis and mitochondrial stress test |
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