Analyse van hematopoietische stam voorlopercellen metabolisme
Summary
Hematopoietische stam voorlopercellen (Hspc’s) overgang van een rusttoestand naar een differentiatie toestand als gevolg van hun metabole plasticiteit tijdens de bloedvorming. Hier presenteren we een geoptimaliseerde methode voor het meten van de mitochondriale ademhaling en glycolyse van Hspc’s.
Abstract
Hematopoietische stam voorlopercellen (Hspc’s) hebben een duidelijke metabole plasticiteit, waardoor ze kunnen overgaan van hun rusttoestand naar een differentiatie toestand om de eisen van de bloedvorming te ondersteunen. Echter, het is moeilijk om de metabole status te analyseren (mitochondriale ademhaling en glycolyse) van Hspc’s vanwege hun beperkte aantallen en het ontbreken van geoptimaliseerde protocollen voor niet-aanhandige, fragiele Hspc’s. Hier bieden we een set van duidelijke, stapsgewijze instructies voor het meten van metabole ademhaling (zuurstofverbruik; OCR) en glycolyse (extracellulaire verzuring; ECAR) van muriene beenmerg-LineageNEGSca1+c-Kit+ (LSK) hspcs. Dit protocol biedt een hogere hoeveelheid LSK-Hspc’s van muriene beenmerg, verbetert de levensvatbaarheid van Hspc’s tijdens de incubatie, vergemakkelijkt extracellulaire flux analyses van niet-aanhangende Hspc’s en biedt geoptimaliseerde injectie protocollen (concentratie en tijd) voor geneesmiddelen gericht op oxidatieve fosforylering en glycolytische trajecten. Deze methode maakt de voorspelling van de metabole status en de gezondheid van Hspc’s tijdens de ontwikkeling van het bloed en ziekten.
Introduction
Aangezien de levensduur van de meeste volwassen bloedcellen kort is, de homeostase van bloed berust op de zelf vernieuwing en differentiatie van een langlevende maar zeldzame populatie van hematopoietische stamcellen (HSPCs)1. Hspc’s zijn stilaan, maar ze zijn snel te vermenigvuldigen en differentiëren op stimulatie om de eisen van het bloedsysteem te ondersteunen. Aangezien elke HSPC cellulaire staat een unieke bioenergetische vraag vereist, zijn de metabole veranderingen belangrijke drijf-en- Daarom, het verlies van metabole plasticiteit, door het veranderen van het evenwicht tussen quiescentie, zelf vernieuwing, en differentiatie van Hspc’s, leidt vaak tot myelo-of LYMPHO-proliferatieve stoornissen. Samen is het begrip van metabole regulering van de ontwikkeling van hspc van cruciaal belang om mechanismen te ontdekken die onderliggende hematologische maligniteiten2,3,4,5vormen.
Mitochondriale ademhaling en glycolyse genereren ATP om intracellulaire reacties te stimuleren en produceren de bouwstenen die nodig zijn voor Macromolecuul synthese. Aangezien Hspc’s lage mitochondriale massa in vergelijking met gedifferentieerde cellen6 en ze ondersteunen quiescentie in hypoxische beenmerg niches, hspc’s voornamelijk vertrouwen op glycolyse. Activering van Hspc’s verbetert hun mitochondriale metabolisme dat leidt tot het verlies van de quiescentie en hun daaropvolgende binnenkomst in de celcyclus. Dergelijke metabole plasticiteit van hspc’s maakt het mogelijk om de hspc-pool te onderhouden gedurende het hele volwassen leven6,7,8,9,10,11,12. Daarom is het van cruciaal belang om hun metabole activiteiten te onderzoeken, zoals het zuurstofverbruik (OCR; index van oxidatieve fosforylering) en de extracellulaire verzuring rate (ECAR; index van glycolyse) om de HSPC-activatie en de gezondheidsstatus te analyseren. Zowel de OCR als de ECAR kunnen gelijktijdig worden gemeten, in real-time, met behulp van een extracellulaire flux Analyzer. De huidige methode vereist echter een groot aantal cellen en is geoptimaliseerd voor aanhandige cellen13. Aangezien Hspc’s niet kunnen worden geïsoleerd in grote hoeveelheden van muizen14, vereisen sortering om een zuivere populatie te verkrijgen, zijn niet-aanhandende cellen15en kunnen niet ‘s nachts worden gekweekt zonder differentiatie te vermijden16, het is moeilijk om de OCR en de ECAR van hspc’s te meten. Hier bieden we een set van duidelijke, stapsgewijze instructies om video-gebaseerde tutorials te begeleiden over het meten van metabole ademhaling en glycolyse van enkele duizenden muriene beenmerg-LineageNEGSca1+c-Kit+ (LSK) hspcs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier tonen we de isolatie van een maximale hoeveelheid zuivere en levensvatbare Murine LSK HSPCs populatie, evenals de meting van hun glycolyse en mitochondriale ademhaling met een extracellulaire flux Analyzer. Het protocol overkomt met name de volgende technische problemen voor het gebruik van LSK Hspc’s: i) de lage frequentie van LSK-Hspc’s in het lymfklier beenmerg14, II) lage basale metabole activiteit van LSK hspc’s26, III) de FRAGILITEIT van LSK hspcs<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt deels gesteund door de steun van de National Institutes of Health (HL131645, CA016058), de Stichting van de St. Baldrick en de Pelotonia Foundation.
Materials
| 0.01% (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | Used for LSK attachment |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used for cell filtration after bone crushing |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi | 130-090-485 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 | BD Biosciences | 553672 | Used for Lin- separation |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | Used for LSK sorting |
| Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | Used for LSK sorting |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001-HI | Used in FACS buffer |
| Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | Used for ficoll gradient separation |
| L-glutamine 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | Used for the assay media |
| LS Column | Miltenyi | 130-042-401 | Used for Lin- separation |
| Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5981-82 | Used for LSK sorting |
| Murine Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | Used for the assay media |
| Murine Thrombopoietin (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | Used for the assay media |
| PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | Used for FACS buffer |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | Used for the assay media |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | P1304MP | Used for LSK sorting |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 | Used for LSK seeding |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher | 11360070 | Used for the assay media |
| Streptavidin eFluor 450 Conjugate | eBioscience | 48-4317-82 | Used for LSK sorting |
| XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | Used for cartridge equilibration |
| XF media | Agilent Technologies | 103575-100 | Used for the assay media |
| XFp Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103017100 | Drugs for glycolysis stress test |
| XFp Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103010100 | Drugs for mitochondrial stress test |
| XFp Sensor Cartridge | Agilent Technologies | 103022-100 | Used for glycolysis and mitochondrial stress test |
References
- Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
- Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).
- Kohli, L., Passegue, E. Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells. Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).
- Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. Metabolism and the leukemic stem cell. The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).
- Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communication. 7, 13125 (2016).
- Anso, E., et al. The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function. Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).
- Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate. Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).
- Maryanovich, M., et al. An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate. Nature Communication. 6, 7901 (2015).
- Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche. Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).
- Zhang, C. C., Sadek, H. A. Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells. Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).
- Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).
- Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).
- Jung, Y., et al. Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche. Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).
- Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Niche-less maintenance of HSCs by 2i. Cell Research. 23, 458-459 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126, 2811-2820 (2015).
- Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).
- Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last. EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).
- Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies. Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).
- Halestrap, A. P., Wilson, M. C. The monocarboxylate transporter family–role and regulation. IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).
- Kim, A. Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders. Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).
- Fosslien, E. Mitochondrial medicine–molecular pathology of defective oxidative phosphorylation. Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).
- Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose. The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).
- Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthetase systems. Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).
- Rimmele, P., et al. Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3. EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).
- Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads. Blood. 119, 1107-1116 (2012).
- Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
