Summary

Monitoreo de las interacciones de GPCR--arrestin1/2 en sistemas de vida en tiempo real para acelerar el descubrimiento de fármacos

Published: June 28, 2019
doi:

Summary

Las interacciones de gpCR-arrestin son un campo emergente en el descubrimiento de fármacos GPCR. Se utilizan métodos precisos, precisos y fáciles de configurar para supervisar dichas interacciones en los sistemas vivos. Mostramos un ensayo de complemento estructural para monitorear las interacciones de la captura de GPCR en células vivas en tiempo real, y se puede extender a cualquier GPCR.

Abstract

Las interacciones entre los receptores acoplados a la proteína G (GPCR) y las arrestinas son procesos vitales con implicaciones fisiológicas de gran importancia. En la actualidad, la caracterización de nuevos fármacos hacia sus interacciones con las arrestinas y otras proteínas citosólicas es extremadamente valiosa en el campo del descubrimiento de fármacos GPCR, especialmente durante el estudio del agonismo sesgado GPCR. Aquí, mostramos la aplicación de un nuevo ensayo de complementación estructural para monitorear con precisión las interacciones de receptores–arrestin en sistemas vivos en tiempo real. Este método es simple, preciso y se puede extender fácilmente a cualquier GPCR de interés y también tiene la ventaja de que supera interacciones inespecíficas debido a la presencia de un promotor de baja expresión presente en cada sistema vectorial. Este ensayo de complemento estructural proporciona características clave que permiten un seguimiento preciso y preciso de las interacciones entre receptores y arrestina, por lo que es adecuado en el estudio del agonismo sesgado de cualquier sistema GPCR, así como de la “fosforilación” de GPCR c-terminus, por lo que es adecuado en el estudio del agonismo sesgado de cualquier sistema GPCR, así como de la c-terminusción GPCR códigos’ escritos por diferentes GPCR-kinases (GRKs) y modificaciones post-traduccionales de arrestinas que estabilizan o desestabilizan el complejo de receptores-arrestina.

Introduction

Los GPCR representan el objetivo de casi el 35% de los fármacos actuales en el mercado1,2 y una comprensión clara de su farmacología es crucial en el desarrollo de nuevos fármacos terapéuticos3. Uno de los aspectos clave en el descubrimiento de fármacos GPCR, particularmente durante el desarrollo de agonistas sesgados es la caracterización de nuevos ligandos hacia las interacciones entre receptores y arrestinas4 y las interacciones de arrestina con otras proteínas citosólicas, tales como como clathrin5.

Se ha documentado que la señalización dependiente de la arrestina desempeña un papel clave en los trastornos neurológicos como el trastorno bipolar, la depresión mayor y la esquizofrenia6 y también los efectos secundarios graves en algunos medicamentos como la morfina7.

Los métodos actuales utilizados para monitorear estas interacciones generalmente no representan los niveles endógenos reales de las proteínas en estudio, en algunos casos muestran señal débil, fotoblanqueo y dependiendo del GPCR podría ser técnicamente difícil configurar8. Este novedoso ensayo de complementación estructural utiliza vectores promotores de baja expresiónpara imitar los niveles fisiológicos endógenos y proporciona una alta sensibilidad en comparación con los métodos actuales 9. Usando este enfoque, fue posible caracterizar fácilmente las interacciones de Galanin receptor—arrestin1/2 y también de la arlatina10. Esta metodología puede ser ampliamente utilizada para cualquier GPCR de particular interés donde las arrestinas juegan una función fisiológica clave o su señalización es relevante en algunas enfermedades.

Protocol

1. Estrategia de diseño de primer Imprimaciones de diseño para introducir genes de interés en pBiT1.1-C [TK/LgBiT], pBiT2.1-C [TK/SmBiT], pBiT1.1-N [TK/LgBiT] y pBiT2.1-N [TK/SmBiT] Vectores. Seleccione al menos uno de estos tres sitios como una de las dos enzimas de restricción únicas necesarias para la clonación direccional debido a la presencia de un codón de parada en trama que divide el sitio de multicloning como se muestra en la Figura 111.<…

Representative Results

Mediante el procedimiento que se presenta aquí, se supervisaron las interacciones entre un GPCR prototípico y dos isoformas de arrestina. Las construcciones de glucagón como el receptor de péptidos (GLP-1r) se hicieron utilizando imprimaciones que contenían sitios de restricción de enzimas NheI y EcoRI y se clonaron en los vectores pBiT1.1-C [TK/LgBiT] y pBiT2.1-C [TK/SmBiT] mientras que en el caso de los vectores pBiT1.1-C [TK/LgBiT] y pBiT2.1-C [TK/SmBiT] mientras que en el caso de los vectores pBiT1.1-C [TK/LgBi…

Discussion

Usando el método que se presenta aquí, las interacciones entre cualquier GPCR y el valor 1/2 se pueden monitorear en sistemas vivos en tiempo real utilizando este ensayo de complementación estructural de GPCR–arrestin. En este sentido, pudimos observar el reclutamiento diferencial de arrestina entre las dos isoformas de arrestina por el GLP-1r (Un prototípico clase B GPCR), también observamos una disociación del complejo del receptor—arrestin a los pocos minutos después de alcanzar el máximo señal luminiscent…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa de Investigación (NRF- 2015M3A9E7029172) de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el Ministerio de Ciencia, TIC y Planificación Futura.

Materials

Antibiotics penicillin streptomycin Welgene LS202-02 Penicillin/Streptomycin
Bacterial Incubator JEIO Tech IB-05G Incubator (Air-Jacket), Basic
Cell culture medium Welgene LM 001-05 DMEM Cell culture medium
Cell culture transfection medium Gibco 31985-070 Optimem 1X cell culture medium
CO2 Incubator NUAIRE NU5720 Direct Heat CO2 Incubator
Digital water bath Lab Tech LWB-122D Digital water bath lab tech
DNA Polymerase proof reading ELPIS Biotech EBT-1011 PfU DNA polymerase
DNA purification kit Cosmogenetech CMP0112 miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini
DNA Taq Polymerase Enzynomics P750 nTaq DNA polymerase
Enzyme restriction BglII New England Biolabs R0144L BglII
Enzyme restriction buffer New England Biolabs B72045 CutSmart 10X Buffer
Enzyme restriction EcoRI New England Biolabs R3101L EcoRI-HF
Enzyme restriction NheI New England Biolabs R01315 NheI
Enzyme restriction XhoI New England Biolabs R0146L XhoI
Fetal Bovine Serum Gibco Canada 12483020 Fetal Bovine Serum
Gel/PCR DNA MiniKit Real Biotech Corporation KH23108 HiYield Gel/PCR DNA MiniKit
Ligase ELPIS Biotech EBT-1025 T4 DNA Ligase
Light microscope Olympus CKX53SF CKX53 Microscope Olympus
lipid transfection reagent Invitrogen 11668-019 Lipofectamine 2000
Luminometer Biotek/Fisher Scientific 12504386 Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers
NanoBiT System Promega N2014 NanoBiT PPI MCS Starter System
Nanoluciferase substrate Promega N2012 Nano-Glo Live Cell assay system
PCR Thermal cycler Eppendorf 6336000015 Master cycler Nexus SX1
Poly-L-lysine Sigma Aldrich P4707-50ML Poly-L-lysine solution
Trypsin EDTA Gibco 25200-056 Trysin EDTA 10X
White Cell culture 96 well plates Corning 3917 Assay Plate 96 well plate

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Cite This Article
Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y., Yun, S., Hwang, J., Seong, J. Y. Monitoring GPCR-β-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery. J. Vis. Exp. (148), e59994, doi:10.3791/59994 (2019).

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