Мониторинг GPCR-я-arrestin1/2 Взаимодействия в режиме реального времени живых систем для ускорения обнаружения наркотиков
Summary
Взаимодействия GPCR-и-arrestin являются новой областью в открытии наркотиков GPCR. Для мониторинга таких взаимодействий в живых системах необходимы точные, точные и простые в настройке методы. Мы показываем структурный контроль комплемента для мониторинга взаимодействия GPCR-я-arrestin в реальном времени живых клеток, и он может быть распространен на любой GPCR.
Abstract
Взаимодействие между G-белковыми рецепторами (GPCRs) и з-арестинами являются жизненно важными процессами с физиологическими последствиями большой важности. В настоящее время характеристика новых препаратов к их взаимодействию с з-арестинов и других цитосолильных белков является чрезвычайно ценным в области GPCR открытие наркотиков особенно во время изучения GPCR предвзятого агонизма. Здесь мы показываем применение нового структурного анализа комплемента для точного мониторинга взаимодействия рецепторов и-арестина в живых системах реального времени. Этот метод прост, точен и может быть легко распространен на любой GPCR интересов, а также он имеет то преимущество, что он преодолевает неспецифические взаимодействия из-за присутствия низкой промоутер выражения присутствует в каждой векторной системе. Это структурное дополнение обзор обеспечивает ключевые особенности, которые позволяют точного и точного мониторинга рецепторов-я-арестина взаимодействий, что делает его пригодным в изучении предвзятого агонизма любой системы GPCR, а также GPCR c-терминус ‘фосфорилирования коды, написанные различными GPCR-киназы (GRKs) и пост-трансляционные изменения арестинов, которые стабилизируют или дестабилизируют рецептор-я-арестин комплекса.
Introduction
GPCRs представляют собой цель почти 35% текущих препаратов на рынке1,2 и четкое понимание их фармакологии имеет решающее значение в разработке новых терапевтических препаратов3. Одним из ключевых аспектов в GPCR открытие наркотиков, особенно во время развития предвзятых агонистов является характеристика новых лиганд оврецепторов к рецептору-и-арестин взаимодействий4 и -арестин взаимодействия с другими цитосолильных белков, таких как как клатрин5.
Было документально подтверждено, что зависимые сигнализации з-арестин играет ключевую роль в неврологических расстройств, таких как биполярное расстройство, тяжелая депрессия, и шизофрения6, а также тяжелые побочные эффекты в некоторых лекарствах, таких как морфин7.
Текущие методы, используемые для мониторинга этих взаимодействий, как правило, не представляют фактические эндогенные уровни белков в исследовании, в некоторых случаях они показывают слабый сигнал, фотоотбеление и в зависимости от GPCR это может быть технически сложно й создать8. Этот новый структурный анализ дополнения использует низкий экспрессионист векторов для того, чтобы имитировать эндогенных физиологических уровней и обеспечивает высокую чувствительность по сравнению с нынешними методами9. Используя этот подход, можно было легко охарактеризовать Галанин рецептор-я-arrestin1’2, а также -arrestin2-клатрин взаимодействий10. Эта методология может быть широко использована для любого GPCR, представляющих особый интерес, где q-arrestins играют ключевую физиологическую функцию или их сигнализация имеет отношение к некоторым заболеваниям.
Protocol
Representative Results
Discussion
Используя представленный здесь метод, взаимодействие между любым GPCR и q-arrestin1/2 можно контролировать в системах жизни в реальном времени, используя этот анализ структурного дополнения GPCR-я-arrestin. В этой связи, мы смогли наблюдать дифференциальный набор и арестин между двумя изообразами gl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Исследовательской программы (NRF- 2015M3A9E7029172) Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемого Министерством науки, ИКТ и будущего планирования.
Materials
| Antibiotics penicillin streptomycin | Welgene | LS202-02 | Penicillin/Streptomycin |
| Bacterial Incubator | JEIO Tech | IB-05G | Incubator (Air-Jacket), Basic |
| Cell culture medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell culture transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| CO2 Incubator | NUAIRE | NU5720 | Direct Heat CO2 Incubator |
| Digital water bath | Lab Tech | LWB-122D | Digital water bath lab tech |
| DNA Polymerase proof reading | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA purification kit | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| Enzyme restriction BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Enzyme restriction buffer | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Enzyme restriction EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Enzyme restriction NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Enzyme restriction XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Canada | 12483020 | Fetal Bovine Serum |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Light microscope | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscope Olympus |
| lipid transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers |
| NanoBiT System | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Nanoluciferase substrate | Promega | N2012 | Nano-Glo Live Cell assay system |
| PCR Thermal cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Poly-L-lysine solution |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| White Cell culture 96 well plates | Corning | 3917 | Assay Plate 96 well plate |
References
- Sriram, K., Insel, P. A. GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs?. Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
- Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
- Langmead, C. J., Summers, R. J. Molecular pharmacology of GPCRs. British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).
- Lohse, M. J., Hoffmann, C. Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors. Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).
- Kang, D. S., et al. Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking. Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).
- Park, S. M., et al. Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice. Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).
- Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).
- Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).
- Dixon, A. S. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor. Communications Biology. 3, 1-128 (2018).
- Promega. . Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , (2019).
- Life Biomedical. . HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , (2019).
- New England BioLabs. . Ligation Calculator. , (2019).
- . . Cosmo Genetech. , (2019).
- Baggio, L. L., Drucker, D. J. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).
- ProMega. . NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , (2019).
- Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences. FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).
