İzleme GPCR-β-arrestin1/2 etkileşimleri gerçek zamanlı yaşam sistemleri Ilaç Discovery hızlandırmak için
Summary
GPCR-β-tutucu etkileşimleri GPCR uyuşturucu keşfi ‘nde ortaya çıkan bir alandır. Canlı sistemlerde bu tür etkileşimleri izlemek için doğru, hassas ve kolay ayarlanabilir Yöntemler gereklidir. Biz gerçek zamanlı yaşam hücrelerinde GPCR-β-tutucu etkileşimleri izlemek için yapısal bir uluslara tahlil göstermek, ve herhangi bir GPCR uzatılabilir.
Abstract
G-protein bağlantılı reseptörler (GPCRs) ve β-tutucu arasındaki etkileşimler, büyük öneme sahip fizyolojik etkileri olan hayati süreçlerden ibaret. Şu anda, yeni ilaçların β-tutucu ve diğer sitosolik proteinleri ile etkileşimlerine yönelik karakterizasyonu, özellikle GPCR önyargılı agonizmin incelenmesi sırasında GPCR uyuşturucu keşfi alanında son derece değerlidir. Burada, biz gerçek zamanlı yaşam sistemlerinde reseptör-β-tutucu etkileşimleri doğru izlemek için bir roman yapısal uluslara tahlil uygulama gösterir. Bu yöntem, basit, doğru ve kolayca herhangi bir GPCR faiz uzatılabilir ve aynı zamanda her vektör sisteminde mevcut bir düşük ifade Organizatör varlığı nedeniyle spesifik olmayan etkileşimlerin üstesinden avantajı vardır. Bu yapısal uluslara tahlil reseptör-β-tutucu etkileşimlerin doğru ve hassas bir şekilde izlenmesi izin temel özellikleri sağlar, herhangi bir GPCR sistemi yanı sıra GPCR c-Terminus ‘ fosforilasyon önyargılı agonizm çalışmada uygun hale farklı GPCR-kinazlar (GRKs) ve reseptör-β-tutucu kompleksini stabilize eden veya istikrarsızlaştıracak olan tutucu sonrası translasyonel değişikliklerle yazılmış kodlar.
Introduction
GPCRs piyasada mevcut ilaçların yaklaşık% 35 hedef temsil1,2 ve onların farmakolojisinin net bir anlayış yeni terapötik ilaçların gelişimi için çok önemlidir3. Özellikle önyargılı agonistlerin gelişimi sırasında GPCR uyuşturucu keşfinin önemli yönlerinden biri, yeni ligizlerin reseptör-β-tutucu etkileşimleri4 ve β-tutucu diğer sitosolik proteinlerle etkileşimlerine doğru karakterize edilmedir. Clathrin5olarak.
Β-tutucu bağımlı sinyalizasyon, bipolar bozukluk, büyük depresyon ve şizofreni6 gibi nörolojik hastalıklarda önemli bir rol oynadığını ve morfin7gibi bazı ilaçlarda da ciddi yan etkileri olduğunu belgelenmiş.
Bu etkileşimleri izlemek için kullanılan geçerli yöntemler genellikle çalışma proteinlerinin gerçek endojen düzeylerini temsil etmez, bazı durumlarda zayıf sinyal, photobleaching ve GPCR bağlı olarak teknik olarak8kurmak zor olabilir gösterir. Bu roman yapısal uluslara tahlil endojen fizyolojik seviyeleri taklit etmek için düşük ifade Organizatör vektörler kullanır ve mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında yüksek hassasiyet sağlar9. Bu yaklaşımı kullanarak, kolayca galanin reseptör-β-arrestin1/2 ve β-arrestin2-Clathrin etkileşimleri karakterize etmek mümkün oldu10. Bu metodoloji, β-tutucunun önemli bir fizyolojik fonksiyon çalabileceği veya sinyallerinin bazı hastalıklarda ilgili olduğu belirli bir ilgi alanı için yaygın olarak kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan yöntemi kullanarak, herhangi bir GPCR ve β-arrestin1/2 arasındaki etkileşimler bu GPCR-β-tutucu yapısal tamamlayıcı tahlil kullanarak gerçek zamanlı yaşam sistemlerinde izlenebilir. Bu bağlamda, GLP-1R (prototip Sınıf B GPCR) tarafından iki β-tutucu isoform arasında diferansiyel β-tutucu işe alma izlenmesini başardık, biz de maksimum ulaştıktan sonra birkaç dakika reseptör-β-tutucu kompleksi bir ayrışma gözlenen Işıksaçan sinyal.
Yapısal tamamlay…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, bilim, BIT ve gelecekteki Planlama Bakanlığı tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) araştırma programı (NRF-2015M3A9E7029172) tarafından hibe tarafından destekleniyordu.
Materials
| Antibiotics penicillin streptomycin | Welgene | LS202-02 | Penicillin/Streptomycin |
| Bacterial Incubator | JEIO Tech | IB-05G | Incubator (Air-Jacket), Basic |
| Cell culture medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell culture transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| CO2 Incubator | NUAIRE | NU5720 | Direct Heat CO2 Incubator |
| Digital water bath | Lab Tech | LWB-122D | Digital water bath lab tech |
| DNA Polymerase proof reading | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA purification kit | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| Enzyme restriction BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Enzyme restriction buffer | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Enzyme restriction EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Enzyme restriction NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Enzyme restriction XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Canada | 12483020 | Fetal Bovine Serum |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Light microscope | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscope Olympus |
| lipid transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers |
| NanoBiT System | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Nanoluciferase substrate | Promega | N2012 | Nano-Glo Live Cell assay system |
| PCR Thermal cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Poly-L-lysine solution |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| White Cell culture 96 well plates | Corning | 3917 | Assay Plate 96 well plate |
References
- Sriram, K., Insel, P. A. GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs?. Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
- Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
- Langmead, C. J., Summers, R. J. Molecular pharmacology of GPCRs. British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).
- Lohse, M. J., Hoffmann, C. Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors. Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).
- Kang, D. S., et al. Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking. Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).
- Park, S. M., et al. Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice. Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).
- Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).
- Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).
- Dixon, A. S. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor. Communications Biology. 3, 1-128 (2018).
- Promega. . Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , (2019).
- Life Biomedical. . HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , (2019).
- New England BioLabs. . Ligation Calculator. , (2019).
- . . Cosmo Genetech. , (2019).
- Baggio, L. L., Drucker, D. J. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).
- ProMega. . NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , (2019).
- Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences. FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).
