Monitoren van GPCR-β-arrestin1/2 interacties in real-time levende systemen om de geneesmiddelen ontdekking te versnellen
Summary
GPCR-β-vanger-interacties zijn een opkomende veld in GPCR-geneesmiddelen ontdekking. Nauwkeurige, nauwkeurige en eenvoudig te stellen methoden zijn nodig om dergelijke interacties in levende systemen te monitoren. We vertonen een structurele complementatie test om de interacties van GPCR-β-de-vanger in real-time levende cellen te monitoren, en deze kan worden uitgebreid naar elke GPCR.
Abstract
Interacties tussen G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) en β-vanger zijn vitale processen met fysiologische implicaties van groot belang. Momenteel is de karakterisering van nieuwe geneesmiddelen naar hun interacties met β-vanger en andere cytosolische eiwitten zeer waardevol op het gebied van GPCR-geneesmiddelen ontdekking, met name tijdens de studie van GPCR-bevooroordeeld agonisme. Hier tonen we de toepassing van een nieuwe structurele complementatie test om nauwkeurig de receptor-β-vanger in interacties in real time levende systemen te bewaken. Deze methode is eenvoudig, nauwkeurig en kan gemakkelijk worden uitgebreid naar elke GPCR van belang en ook heeft het voordeel dat het overkomt onspecifieke interacties als gevolg van de aanwezigheid van een lage expressie promotor aanwezig zijn in elk vector systeem. Deze structurele complementatie test biedt belangrijke kenmerken die een nauwkeurige en nauwkeurige controle van receptor-β-vanger interacties mogelijk maken, waardoor het geschikt is in de studie van bevooroordeeld agonisme van elk GPCR-systeem en GPCR c-Terminus ‘ fosforylering codes ‘ geschreven door verschillende GPCR-kinases (GRKs) en post-translationele modificaties van afvallen die het receptor-β-afradercomplex stabiliseren of destabiliseren.
Introduction
Gpcrs vertegenwoordigen het doel van bijna 35% van de huidige drugs in de markt1,2 en een duidelijk begrip van hun farmacologie is cruciaal in de ontwikkeling van nieuwe therapeutische geneesmiddelen3. Een van de belangrijkste aspecten bij de ontdekking van GPCR-geneesmiddelen, in het bijzonder tijdens de ontwikkeling van partijdige agonisten, is de karakterisering van roman liganden naar receptor-β-dein interacties4 -en β-dein interacties met andere cytosolische eiwitten, zoals Als clathrin5.
Er is gedocumenteerd dat de afhankelijke signalering van β-vanger een belangrijke rol speelt bij neurologische aandoeningen zoals bipolaire stoornis, ernstige depressie en schizofrenie6 en ook ernstige bijwerkingen in sommige medicijnen zoals morfine7.
De huidige methoden die worden gebruikt om deze interacties te bewaken, vertegenwoordigen meestal niet de werkelijke endogene niveaus van de eiwitten in studie, in sommige gevallen vertonen ze een zwak signaal, fotobleaching en afhankelijk van de GPCR kan het technisch lastig zijn om8in te stellen. Deze roman Structural complementatie test maakt gebruik van lage expressie Promoter vectoren om endogene fysiologische niveaus na te bootsen en biedt een hoge gevoeligheid in vergelijking met de huidige methoden9. Met behulp van deze aanpak, was het mogelijk om te karakteriseren Galanin receptor-β-arrestin1/2 en ook β-arrestin2-clathrin interacties10. Deze methodologie kan op grote schaal worden gebruikt voor elke GPCR van bijzonder belang waar β-vanger een belangrijke fysiologische functie speelt of de signalering relevant is bij sommige ziekten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met behulp van de hier gepresenteerde methode kunnen interacties tussen GPCR en β-arrestin1/2 worden bewaakt in real time levende systemen met deze GPCR-β-vanger in structurele complementatie test. In dit verband waren we in staat om de differentiële β-vanger in de rekrutering tussen de twee β–vanger-isovormen te observeren door de GLP-1R (een prototypische klasse B GPCR), we observeerden ook een dissociatie van de receptor-β-vanger in complex enkele minuten na het bereiken van de maximale lichtgevende signaal.</p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies van het onderzoeksprogramma (NRF-2015M3A9E7029172) van de National Research Foundation of Korea (NRF), gefinancierd door het ministerie van Wetenschappen, ICT en toekomstige planning.
Materials
| Antibiotics penicillin streptomycin | Welgene | LS202-02 | Penicillin/Streptomycin |
| Bacterial Incubator | JEIO Tech | IB-05G | Incubator (Air-Jacket), Basic |
| Cell culture medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell culture transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| CO2 Incubator | NUAIRE | NU5720 | Direct Heat CO2 Incubator |
| Digital water bath | Lab Tech | LWB-122D | Digital water bath lab tech |
| DNA Polymerase proof reading | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA purification kit | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| Enzyme restriction BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Enzyme restriction buffer | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Enzyme restriction EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Enzyme restriction NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Enzyme restriction XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Canada | 12483020 | Fetal Bovine Serum |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Light microscope | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscope Olympus |
| lipid transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers |
| NanoBiT System | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Nanoluciferase substrate | Promega | N2012 | Nano-Glo Live Cell assay system |
| PCR Thermal cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Poly-L-lysine solution |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| White Cell culture 96 well plates | Corning | 3917 | Assay Plate 96 well plate |
References
- Sriram, K., Insel, P. A. GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs?. Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
- Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
- Langmead, C. J., Summers, R. J. Molecular pharmacology of GPCRs. British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).
- Lohse, M. J., Hoffmann, C. Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors. Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).
- Kang, D. S., et al. Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking. Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).
- Park, S. M., et al. Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice. Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).
- Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).
- Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).
- Dixon, A. S. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor. Communications Biology. 3, 1-128 (2018).
- Promega. . Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , (2019).
- Life Biomedical. . HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , (2019).
- New England BioLabs. . Ligation Calculator. , (2019).
- . . Cosmo Genetech. , (2019).
- Baggio, L. L., Drucker, D. J. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).
- ProMega. . NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , (2019).
- Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences. FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).
