Überwachung von GPCR---Arrestin1/2-Interaktionen in Echtzeit-Lebenssystemen zur Beschleunigung der Arzneimittelentdeckung
Summary
GPCR—-Arrestin-Wechselwirkungen sind ein aufstrebendes Feld in GPCR-Medikamentenentdeckung. Genaue, präzise und einfach einzurichtende Methoden sind notwendig, um solche Wechselwirkungen in lebenden Systemen zu überwachen. Wir zeigen einen strukturellen Komplementierungstest zur Überwachung der GPCR—-Arrestin-Interaktionen in Echtzeit lebenden Zellen und können auf jede GPCR erweitert werden.
Abstract
Wechselwirkungen zwischen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) und A-Arrestinen sind lebenswichtige Prozesse mit physiologischen Implikationen von großer Bedeutung. Derzeit ist die Charakterisierung neuartiger Medikamente in Bezug auf ihre Wechselwirkungen mit ‘-Arrestinen und anderen zytosolischen Proteinen im Bereich der GPCR-Medikamentenentdeckung besonders während der Untersuchung des GPCR-voreingenommenen Agonismus äußerst wertvoll. Hier zeigen wir die Anwendung eines neuartigen strukturellen Komplementierungs-Assays zur genauen Überwachung von Rezeptor—-Arrestin-Interaktionen in Echtzeit-Lebenssystemen. Diese Methode ist einfach, genau und kann leicht auf jede GPCR von Interesse erweitert werden und hat auch den Vorteil, dass sie unspezifische Wechselwirkungen aufgrund des Vorhandenseins eines Low-Expression-Promotors in jedem Vektorsystem überwindet. Dieser strukturelle Komplementierungstest bietet Schlüsselmerkmale, die eine genaue und präzise Überwachung der Rezeptor—Arrestin-Wechselwirkungen ermöglichen, wodurch er für die Untersuchung des voreingenommenen Agonismus eines BELIEBIGEN GPCR-Systems sowie der GPCR-c-terminus-Phosphorylierung geeignet ist. Codes’ geschrieben von verschiedenen GPCR-Kinasen (GRKs) und post-translationale Modifikationen von Arrestinen, die den Rezeptor—Arrestin-Komplex stabilisieren oder destabilisieren.
Introduction
GPCRs stellen das Ziel von fast 35% der aktuellen Medikamente auf dem Markt1,2 dar, und ein klares Verständnis ihrer Pharmakologie ist entscheidend für die Entwicklung neuartiger therapeutischer Medikamente3. Einer der Schlüsselaspekte bei der Entdeckung von GPCR-Medikamenten, insbesondere bei der Entwicklung von voreingenommenen Agonisten, ist die Charakterisierung neuartiger Liganden hin zu Rezeptor—Arrestin-Wechselwirkungen4 und wie clathrin5.
Es wurde dokumentiert, dass die abhängige Signalisierung von ‘-arrestin eine Schlüsselrolle bei neurologischen Störungen wie bipolarer Störung, schwerer Depression und Schizophrenie6 sowie schweren Nebenwirkungen in einigen Medikamenten wie Morphin7spielt.
Aktuelle Methoden zur Überwachung dieser Wechselwirkungen stellen in der Regel keine tatsächlichen endogenen Werte der Proteine in der Studie dar, in einigen Fällen zeigen sie schwaches Signal, Photobleichung und je nach GPCR könnte es technisch schwierig sein,8einzurichten. Dieser neuartige strukturelle Komplementierungstest verwendet Vektoren mit niedrigem Ausdruckspromotor, um endogene physiologische Werte nachzuahmen und bietet eine hohe Empfindlichkeit im Vergleich zu aktuellen Methoden9. Mit diesem Ansatz war es möglich, Galanin-Rezeptor—Arrestin1/2 und auch die Wechselwirkungenvon10 -, arrestin2-clathrin, leicht zu charakterisieren. Diese Methode kann weit verbreitet für jede GPCR von besonderem Interesse verwendet werden, wo die ‘-Arrestine eine wichtige physiologische Funktion spielen oder ihre Signalisierung bei einigen Krankheiten relevant ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit der hier vorgestellten Methode können Die Wechselwirkungen zwischen jedem GPCR und dem ‘-arrestin1’2 in Echtzeit-Lebendenmitsystemen mit diesem GPCR—Arrestin-Strukturkomplementierungstest überwacht werden. In diesem Zusammenhang konnten wir die unterschiedliche Rekrutierung von -Arrestin-Rekrutierungen zwischen den beiden -arrestin-Isoformen durch die GLP-1r (A prototypische Klasse B GPCR) beobachten, wir beobachteten auch eine Dissoziation des Rezeptor—Arrestin-Komplexes wenige Minuten nach Erreichen des Lumin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Stipendien des Forschungsprogramms (NRF- 2015M3A9E7029172) der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, das vom Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunftsplanung finanziert wird.
Materials
| Antibiotics penicillin streptomycin | Welgene | LS202-02 | Penicillin/Streptomycin |
| Bacterial Incubator | JEIO Tech | IB-05G | Incubator (Air-Jacket), Basic |
| Cell culture medium | Welgene | LM 001-05 | DMEM Cell culture medium |
| Cell culture transfection medium | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X cell culture medium |
| CO2 Incubator | NUAIRE | NU5720 | Direct Heat CO2 Incubator |
| Digital water bath | Lab Tech | LWB-122D | Digital water bath lab tech |
| DNA Polymerase proof reading | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU DNA polymerase |
| DNA purification kit | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini |
| DNA Taq Polymerase | Enzynomics | P750 | nTaq DNA polymerase |
| Enzyme restriction BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Enzyme restriction buffer | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Buffer |
| Enzyme restriction EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Enzyme restriction NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Enzyme restriction XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Fetal Bovine Serum | Gibco Canada | 12483020 | Fetal Bovine Serum |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligase | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Light microscope | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscope Olympus |
| lipid transfection reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometer | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers |
| NanoBiT System | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Nanoluciferase substrate | Promega | N2012 | Nano-Glo Live Cell assay system |
| PCR Thermal cycler | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Poly-L-lysine solution |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| White Cell culture 96 well plates | Corning | 3917 | Assay Plate 96 well plate |
References
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