CRISPR-Cas9を用いたミツバチ脳部における抗RDLおよび抗mGlutR1受容体抗体検査

ここで説明するプロトコルは、アリゾナ州立大学の動物ケアガイドラインに従います. 1.アピス・メリプラの脳からのタンパク質の完全分離 注:この実験には、未知の年齢のアピスメルビデラ新世界カルニオラン飼料を使用してください。 ハイブの入り口にアルミメッシュスクリーンを置き、偽造者のミツバチ17を捕獲する。各キャップに小さな穴を開けてバイアルで各ビーを捕捉します。ミツバチを含むバイアルを氷に入れて体温を下げ、固定します。ミツバチは氷の中に3分以内に置いておく。 固定化されたミツバチを以前に準備した金属ホルダーに固定します。金属ホルダーが小さなダクトテープで固定できるように構築されていることを確認しますが、背胸部、翼、およびヘッドが露出したままです。注意: ミツバチをホルダーに入れる前に、完全に固定化してください。 ミツバチに5 mLシリンジを使用して1Mスクロース溶液を供給し、空腹でなくなるまで供給します。湿気の多い環境を確保するために、湿ったペーパータオルで箱に固定されたミツバチを置きます。 バラカーアイリスはさみ(材料表を参照)で頭を切り落とし、ハサミを使って頭を正面から開いて、ハチの脳を素早く解剖します。 頭部カプセルから脳を切断し、#5鉗子で脳を取り、100 μLの冷たい(4-8°C)のリシスバッファーに入れます。リシスバッファーは、120 mM トリス-HCl から構成され、 2%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、5%グリセロール、0.2mMジチオトレイトール、1%トリトンX-100、およびプロテアーゼ阻害剤PMSF(フェニルメチルスルホニルフルホライド)の1-5 μg/mL、アプロチニン、ベンズアミジン(pH 6.8)を4°Cで行う。約2分間の害虫を回すことによって、溶解溶液中の脳を均質化する。 サンプルを12,000 x gで20分間遠心分離し、上清の90μLを吸引し、ペレットを捨てます。 上清の1μLを取り、フルオリメーターを使用して総タンパク質を定量します。総タンパク質のおよその濃度は、1個のハビ当たり2〜3mg/mLの間であった。上清の10μLを取り、6x Laemmliバッファ18の10μLのリシスバッファーと10μLを加える。短く回転して3分間煮てから氷の上で冷やします。10,000 x gで1分間スピンして、すべての破片を取り除く。10分の1の小さなビンには、約25ngの総タンパク質が含まれています。 2. ウェスタンブロッティング19 12.15 mLの超純蒸留水を含む10%のランニングジェルの30 mLを作り、 7.5 MトリスHClの7.5 mL(pH 8.8)、10%SDSの0.3 mL、アクリルアミドビスアクリルアミド溶液30%の10mL、10%のアンモニウム過硫酸(APS)の0.15mL、テトラメチルエチジレンアミン(TEMED)の20μL). スペーサーで分離された2枚のガラス板の間にゲルをキャストします。 12.1 mLの超純蒸留水、5.0 mLの0.5 M Tris-HCl(pH 6.8)、10%SDSの0.2mL、アクリルビスアクリルアミドの2.6mL、10%APSの0.1mL、および20μLのTEMEDを含む20mLの積層ゲルを作ります。 ランニングジェルが固化すると、積層ゲルを注ぎます。慎重に泡を避け、ローディングレーンをキャストするためにプラスチックセパレータを追加します。ゲルが固まるまで15~30分待ちます。 5 μLのタンパク質規格を使用してゲルのローディングを開始します。ステップ1.8から1レーン当たり20μLのライセート混合物をロードし、ハチ脳の約1/15または1レーンあたり約16ngの総タンパク質に相当する。積層ゲルでは16 mA、ランニングジェルでは32 mAで、合計3.5~4時間のサンプルを実行します。染料がゲルから出るときは止まる。 タンパク質を、0.45 mAでのトランスファーバッファー(25 mM Tris-HCl、192 mMグリシン、15%メタノール)で4°Cで1h 30分間、ニトロセルロース膜に移します。 免疫ブロッティングの前にSDS-PAGEに続くタンパク質の転写の効率を評価するために、ポンソーS染色液を加える(100mLの最終体積に水に0.1 gのポンソーSおよび5 mLの酢酸を加える)。4°Cで1分間保存し、蒸留水で素早くすすいでください。 ボールペンで各レーンにラベルを付け、脳ホモジネートと1レーンを含む膜をタンパク質マーカーで切り、それぞれウェスタンブロットインキュベーションボックスに入れます。0.1%Tween 20(PBS-Tw)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でそれぞれ5分間3xを洗浄する。 ウェスタンブロットインキュベーションボックスで10%NGS(通常のヤギ血清からPBS-TWの1mLまで)で膜を遮断し、抗mGlutR1希釈(10%NGSの10mLで5μLの抗体)を作ります。抗RDL1および抗RDL2希釈(10%NGSの10 mLで5 μLの抗体)を作ります。各箱のブロッキング溶液を希釈抗体と交換し、4°Cで一晩(16-24時間)放置します。 PBS-Twで膜3倍をそれぞれ5分間洗浄し、抗ウサギIgG HRP-共役二次抗体を用いて膜を1:10,000で1:10,000で1:10,000で室温で2時間洗浄します(RT)。膜をPBS-Twで3倍、PBSで1xを洗浄する。 ウェスタン化学発光HRP基板を使用してバンドを検出します。RTで2つの基質1:1(v/v)を混合し、すべての膜を同じボックスに入れ、RTで2分間(赤色の光が入った暗い部屋で)基板ミックスで覆います。通常、1つの抗体は、2または3レーンの脳ホモジネートの同一希釈を含む1つの膜上で試験され、1レーンは重量マーカーを有する。 3. 免疫細胞化学的手続き 免疫細胞化学のためにミツバチの脳を解剖するには、ミツバチを氷の中に30秒間固定する。ミツバチを固定化した後、ハサミでミツバチを切り落とし、頭をPBSの4%パラホルムアルデヒドの溶液に入れる。ヒュームフードの下で作業します。注意:腹部は切断後も刺すことができるので、体は慎重に処分する必要があります。 慎重に、迅速にアンテナ、複合目を削除し、バラカーアイリスはさみで上部外骨格の周りすべてをカット。頭部を10分間固定液に座らします。残りの頭の外骨格を取り除き、残りの気管を全て切断します。 各脳を4%パラホルムアルデヒド溶液の少なくとも1mLを含む1.5mLマイクロ遠心チューブに入れ、4〜8°Cで一晩放置する。 3.8 gのアガロースと50 mLの蒸留水を三本のフラスコに混合して、7.6%のアガロース溶液を作ります。アガロースが液化するまで溶液をマイクロ波で行う。注:加熱中にアガロース溶液があふれるのを防ぐために、フラスコの開口部に小さなティッシュペーパーを置くことができます。 35mmのペトリ皿に固定されたミツバチの脳(3-4脳)を入れ、ティッシュペーパーで余分な固定剤を取り除きます。液体アガロース溶液を脳の上に注ぎます。アンテナローブが上向きになるようにアガロースの脳の向きを向きます。アガロースを冷却し、固める。 アガロースが固まった後、脳を含むアガロースのブロックを切り取る。 ビブラートメの断面のために、底部に疎水性メッシュを有するバスケットを含む各ウェルで24ウェルプレートを準備する。600 μLのPBSで各ウェルを満たします。 ビブラームマシンを使用して各ブロックを70 μmの断面にカットし、PBSを含むバスケットにセクションを入れます。注:同じ脳のセクションが同じバスケットに入っていることを確認してください。 脳セクションを6xで10分間PBS-TXで洗い、セクションに固定性が残らないようにします。多ウェルプレートを軌道シェーカーに置き、210 rpmで脳を洗います。各洗浄の前に、新鮮なPBS-TX溶液でPBS-TX溶液を交換してください。最後の洗浄中に1%の通常のロバ血清でブロックします。 抗m-glutR1一次抗体を試験するために、15 mL遠心管にPBS-TXの9 mLを80 μLの抗mGlutR1抗体を加えることによって抗mGlutR1抗体の1:112希釈を調製する。チューブを短くボルテックスして、完全に混ぜます。抗体の働く希釈を予備実験で決定した。 抗RDL一次抗体を試験するために、抗RDLペプチド1の30μL、抗RDLペプチド2の30μL、およびPBS-TXの6 mLを15mL遠心管に添加することにより、抗RDL抗体の1:100希釈を調製する。チューブを短くボルテックスして、完全に混ぜます。抗体の働く希釈を予備実験で決定した。 プレートの各ウェルに800 μLの抗体溶液を加えます。マルチウェルプレートを覆い、アルミニウム箔で包み、光暴露による劣化を防ぎます。プレートをアルビタルシェーカーにアルミニウム箔で包み、2時間210rpmで振ります。その後、揺れることなくRTで一晩放置します。 脳切片が一晩放置された後、PBS-TXで10分間洗浄します。 PBS-TXの9 mLに40μLの二次抗体を加えて2次抗体を1:225希釈して、二次抗体(ロバ由来の抗ウサギ)を準備します。 各ウェルに800μLの二次抗体希釈を加える。プレートを覆い、アルミホイルで包みます。プレートをアルビタルシェーカーにアルミニウム箔で包み、2時間210rpmで振ります。その後、RTで一晩それを残します。 脳切片を10分間、PBS-TXで洗浄し、3xを通常のPBS溶液で洗う。 スライドにセクションを埋め込むには、ロドリゲスら20から改変された取り付け培地/グリセロール埋め込み溶液を準備する。20 mL PBSに5gの取り付け媒体を加え、磁気攪拌機で16時間かき混ぜます。グリセロール10mLを加え、磁気攪拌機でさらに16時間かき混ぜます。遠心分離機は4,000×gで15分間、液体均質な上清を取り、1mLチューブにアリコートを取ります。-20 °Cに保つ ステップ3.17で準備された取り付け媒体のドロップでスライドにセクションを埋め込み、各スライドに1つの脳からのセクションが含まれていることを確認します。 共役ペプチドによる免疫染色の前触制御 抗RDLおよび共役ペプチドの場合、対応するペプチドコンジュゲートを有する抗RDL抗体の働く希釈を、RTで一晩シェーカーで結合する:条件1)グルタルアルデヒドを介してキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)と共役した500μgペプチド。コンジュゲートなしの条件2) 各混合物を10,000 x gで10分間遠心分離し、両方の条件から上清を収集します(ステップ3.19.1)。 上述の二次抗体を用いて、各上清とプロセスを用いてミツバチ脳の連続セクションをインキュベートする。連続セクションは、ビブラートメの断面手順の間に互いに続くセクションであるため、脳の同じ部分が正と負のコントロールにさらされる。 抗mGlutR1および共役ペプチドの場合、10-4Mペプチドを含有するKLH共役ペプチド(条件1)を有するKLH共役ペプチドを有する抗mGlutR1抗体の働く希釈を、コンジュゲートなしで(条件2)、RTでインキュベートする。 10,000 x gで各混合物を10分間遠心分離し、両方のコントロールから上清を収集します。 二次抗体との両方の条件とプロセスから上清でミツバチの脳の連続セクションをインキュベートします(ステップ3.14-3.15)。 埋め込みメディアを使用して、両方の条件のセクションをスライドに埋め込みます(ステップ 3.17)。 4. 対応するCRISPR-Cas9系の注射後のミツバチ脳における免疫細胞化学によるRDLおよびmGlutR1タンパク質発現の試験(セクション3) AmRdl (XM_006565102.3) のゲノム DNA 配列と mGlutR1 (XM_006566244.3) の配列を使用して、オンラインの CRISPR-Cas9 設計ツール21を使用してガイドを設計します (表 1)。5’末端に蛍光色素ATTO550を有するCas9 crRNAおよびCas-9トラクルRNAとして命令する。Cas9 ヌクレアーゼ V3 を注文する (資料の表を参照)。 ヌクレアーゼフリー水を用いて各ガイドcrRNAとtracrRNAの100 μMストックを作り、CRISPR-Cas 9システムのコンポーネントを準備します。アリコートと-20°Cに保管してください。Cas-9溶液の働き濃度を2.5 μLのCas 9ヌクレアーゼV3(10 mg/mL)を47.5μLのヌクレオチドフリーバッファーに添加し、0.5 μg/μLの最終濃度を得る。 ガイドRNAごとにgRNA複合体形成を個別に準備する(ガイドRNA:トラクルRNAATTO550) gRNAの名前を持つ試験管にラベルを付け、ヌクレオチドフリーバッファーの92μL、100 μM CRISPR-Cas9トラクルRNA-5’ATTO550の4μL、および4 μLのガイドcrRNA溶液を加えます。穏やかに混ぜて回転させます。注: RDL 用 gRNA チューブの標識の例: GRDL1、 GRDL2、 GRDL3 (表1の RDL ガイド RNA に対応)。mGlutR1に対する gRNA チューブの標識の例: GMGL1, GMGL2, GMGL3 (表 1) 溶液を5分間95°Cに加熱し、gRNAを作成します。RTで10分間冷やします。 RNP複合体形成(gRNA:S.p Cas9Nuclease)、送達混合物、および制御を調製する。 試験管にRNPの名称を付け、6 μLのgRNA溶液と6 μLの0.5 μg/μL S.p Cas9ヌクレアーゼV3を加えます。穏やかに混合し、注入の前に10分間37 °Cで溶液をインキュベートします。注: RNP チューブ ラベルの例: RRDL1、RRDL2、RRDL3。 RNPRDLミックスを作ります。注射に使用する最終的な混合物を調製するには、RDLから各RNPの4 μLを一緒に加えます。RNP/RDL ミックス = 4 μL RRDL1 + 4 μL RRDL + 4 μL RRDL3. RNPmGlutR1ミックスを作ります。mGlutR1から各RNPの4μLを混ぜ合わせて、注射に使用される最終的な混合物(RNPmGlutR1mix)=4 μL RMG1 + 4 μL RMG2 + 4 μL RMG3を調製します。注: RNP チューブ ラベルの例: RMG1、RMG2、RMG3。 ガイドRNAの代わりに4μLのトラクルRNA、92μLのバッファー、4μLの水を混合して、コントロールのnoguideRNA溶液を作ります(セクション4.3を参照)。このノーガイドRNA溶液の6μLと6 μLの0.5 μg/μL Cas9ヌクレアーゼV3(ステップ4.4.1)を混合して、制御注入液を生成します。 5. 注射手順 ステップ 1.3 で説明したように各ビーを固定化し、ステップ 1.4 のように餌を与えます。次に、注入後にミツバチを解放するために2つの木箱の2セットを準備します:白い箱(実験条件)とブラックボックス(コントロール)。各ボックスには、小さな櫛と給餌ペトリ皿が含まれている必要があります。各箱の片側は観察を可能にするガラスで作られています。 ペトリ料理を食べさせる。35mmのペトリ皿のカバーを取り、表面の内側にワックスを置き、ペトリ皿の底部をワックスの上に置きます。プレートを箱に固定します。 5 mL シリンジを使用して、カバーと皿の底部の間に 1M のスクロース溶液を注入します。ミツバチはすぐに2つのプレートの間にプロボシスを置ることができ、48時間のインキュベーション期間乾燥したままになります。各箱に1皿入れます。 マイクロインジェクションシステムを準備するには、気泡を含まない鉱油で毛細血管を充填します。マイクロインジェクションシステムのインジェクターホルダに毛細血管を入れます。所望の注入溶液で毛細管をロードするには、疎水性フィルムを平らな表面に置き、溶液をその上にピペットで置きます。毛細血管から油を注入し、対応するRNPミックスと混合物を交換します。 マイクロインジェクションシステムを使用して、345 nLのRNP混合物溶液を各ビーの中央値オセリに直接注入します。 RDL-CRISPR-Cas9注入の場合、ステップ4.4.2で説明したように調製したRNPRDLmixで8匹のミツバチを注入します。注射後に1Mスクロースを供給する。小さな櫛を入れて白い(実験)箱に入れ、ペトリ皿に48時間餌を与え、注射をせずにコントロールとして別の8匹のミツバチを使用し、それらを供給し、黒い(コントロール)ボックスに放します。 mGlutR1 CRISPR-Cas9 の場合、ステップ 4.4.3 で説明したように調製された RNPmGlutR1mix で 9 匹のミツバチを注入します。コントロール用に、ステップ4.4.4に記載されているように準備されたガイド(RNAmix_noguide)なしでRNA混合物を用いて8匹のミツバチを注入する。注射後に1Mスクロースを供給する。5.1章で説明したように、そのホルダーから白い箱(実験条件)またはブラックボックス(コントロール)にミツバチを放します。 湿気のために、箱を濡れた紙を入れたポリスチレン容器に入れます。ミツバチを48時間放置し、1日あたり2倍の状態で十分な食べ物と湿度を確保します。 48時間後に各ハチの脳を解剖し(ステップ3.1)、第3節に記載されているように免疫細胞化学のプロセスを行う。抗m-glutR1免疫染色にはステップ3.11を使用し、抗RDL免疫染色にはステップ3.12を使用します。 免疫染色脳切片における蛍光のレベルを評価するために共焦点イメージングを行う。 免疫標識された脳におけるタンパク質の減少を評価するために、制御および注入された脳の両方に同じレベルの利得で共焦点画像収集を使用する。 6. qPCRベースのドロップオフアッセイで、CRISPR Cas9 RNPRDLmixインジェクション後に改変されたゲノムRDL DNA 48 Hを評価する CRISPR-Cas9注入によって修飾されたDNAの量を評価するためにプライマー、制御プローブ、およびドロップオフプローブを設計します。各プライマーは、少なくとも1つのCRISPR-Cas 9ガイドを横たわるように設計されており、アンプリコンサイズは132 bpです。使用されるプライマーとプローブは以下の通りです:RDL1_For: CTCGGAGTGACCACCGTRDL1_Rev: カカガグガカッカッカツコRDL1_control_probe: /5HEX/CGA+C+G+TTT + A + C + CT/3IABkFQ/RDL1_Dropoff_probe: /56-FAM/CCTA+ C + G + T + CA + A + GT/3IABkFQ/ プライマーが、その領域に固有の固有のシーケンスに対応していることを確認します。ドロップオフプローブがRDL-CRISPR-Cas9ガイドと重複するエリア用に設計されていることを確認します。 ガイド領域にgDNAの修飾があるかどうかをテストするには、ステップ5.3.1で説明したRNP_RDLミックスでオセリに12匹のミツバチを注入し、8つの未注入ミツバチをコントロールとして使用します。 注射後に48時間の視葉なしでミツバチの脳を解剖し、各注入のgDNAを抽出し、製造業者のプロトコルに従ってキットを使用して(視葉なしで)ミツバチの脳を制御します(材料表を参照)。 分光光度計を用いて抽出したgDNAの量、品質、純度を評価します。 qPCRベースのドロップオフプロトコルとリアルタイムPCRサイクラーを用いて、AmRDLの修飾されたgDNAの相対発現を定量化します。 オリゴを100μMに再懸濁し、プライマーを10μMに希釈し、プローブを5μMに希釈します。 gDNAの1つのサンプル(3回の繰り返し)に対してここに示すように96ウェルプレートにPCR反応を設定します:マスターミックスの10μL(材料表を参照)、フォワードプライマーの1μL、リバースプライマーの1μL、1μLの制御プローブ、1μLの降下プローブ、2μLのgDNA(50ng)、4μLのヌクレアーゼフリー水を最終体積に導きます。注: コントロールは、プローブの代わりにサンプルと水の代わりにソリューションです。 リアルタイムPCRサイクラーに対しては、95°C、15sの95°C、1分間60°Cの40サイクルを設定します。 2-ΔΔCt法を用いて相対遺伝子修飾を評価するそして 7. RNPRDLmixインジェクション後のRDL RNA 48 Hの相対定量 RDL mRNAの減少があるかどうかをテストするために、ステップ5.3.1で説明したようにRNP_RDLミックスでオセリに20個のミツバチを注入し、コントロールとして12個の未注入ミツバチを使用します。注射後48時間でミツバチの脳(視葉を除く)を解剖し、注入された各ミツバチから合計mRNAを抽出し、製造業者のプロトコルを使用して分離します(材料表を参照)。 DNA フリーキットを使用してサンプルに残っている DNA 残渣を除去します (材料表を参照)。 分光光度計を用いて抽出したRNAの品質と純度を評価します。 384 ウェルプレートのメーカーのプロトコルを使用して、市販の蛍光性緑色RT-PCRキット(材料表)を使用してAmRDLの発現を定量化します。注: この実験では、以前に公開されたプライマーが使用されました。アウル(AmRDL_Fのために;AmRDL_R TCGATCGACTATGACGTAGGA)22およびアクチンプライマーを参照遺伝子として [AmActin_F TGCCAACTGTTTTCTG;ガートガCCCカアトッカ]AmActin_R 23.相対遺伝子発現を2-ΔΔCt法を用いて算出した(ステップ6.6)。 8. qPCR ベースのドロップオフアッセイにより、RNPmGlutR1mix インジェクション後に改変されたゲノム DNA 48 H を評価 CRISPR-Cas9注射によって修飾されたDNAの量を評価するためにプライマー、制御、およびドロップオフプローブを設計します。少なくとも1つのCRISPR-Cas 9ガイドとアンプリコンサイズが96 bpになるようにプライマーを設計します。mGlutR1_For: グトガアッカッガCGGAガガガAmGlurR1_Rev: ガガガガガガガガーAmGlurR1_control_probe: /5HEX/CGAGG +G+AAA +CGA +GT/3IABkFQ/AmGlurR1_Dropoff_probe: /56-FAM/CGA+ C + C + C + CG + TC/3IABkFQ/注: プライマーが、変更する必要がある領域に固有の固有のシーケンスに対応していることを確認してください。ドロップオフプローブは、CRISPR-Cas9ガイドと重なった領域向けに設計されています。 ガイド領域にgDNAの修飾があるかどうかをテストするには、ステップ5.3.1で説明したように、RNP_GlutR1ミックスでオセリに12匹のミツバチを注入し、コントロールとして8つの未注入ミツバチを使用します。 注入後48時間のミツバチの脳(視葉なし)を解剖し、製造業者のプロトコルを使用して(視葉を除いて)各注入および制御ミツバチ脳(視葉なし)からgDNAを抽出します(材料表を参照)。 分光光度計を用いて抽出したgDNAの量、品質、純度を評価します。 qPCR ドロップオフプロトコルとリアルタイム PCR サイクラーを使用して、ステップ 6.5 で説明されているように、gDNA AmGlutR1 の相対改変を定量化します。 2-ΔΔCt法を用いて相対遺伝子修飾を評価するそして 9. rnPmGlutR1mixインジェクション後のmGlutR1 RNA 48時間の定量 mGlutR1 RNA mRNAの減少があるかどうかをテストするために、ステップ5.3.2で説明したようにRNP_RDLミックスを用いてオセリに6匹のミツバチを注入し、6つの未注入ミツバチをコントロールとして使用します。注射後48時間でミツバチの脳(視葉を除く)を解剖し、注入された各ミツバチから合計mRNAを抽出し、RNA分離のための製造業者のプロトコルを使用して分離する(材料表参照)。 DNA フリーキットを使用してサンプルに残っている DNA 残渣を除去します (材料表を参照)。 分光光度計を用いて抽出したRNAの品質と純度を評価します。 384 ウェルキットに提供されたプロトコルを使用して、リアルタイム PCR サイクラーで SYBR グリーン RT-PCR キット (「マテリアルの表」を参照) を使用してmGlutR1の発現を定量化します。mGlutR1 (mGlut_F CCTCCTACGTGTGTGTGTGTGTATTTT; mGlut_R TGCCGTGTGTGTGTGTGTTTTTT) およびアクチンプライマーを参照遺伝子として使用するには、次のプライマーを使用します [AmActin_F TGCCAACTGTTTTCTG;AmActin_RガートガCCCカチャアトッカ]。2-ΔΔCt法を用いて相対的な遺伝子発現を計算する(ステップ8.6)。