Анти-RDL и Anti-mGlutR1 Рецепторы Антитела Тестирование в медоносных пчел мозга разделы с помощью CRISPR-Cas9
Summary
Представлен протокол для использования системы CRISPR-Cas9 для сокращения производства белка во взрослом мозге пчел для проверки специфики антител.
Abstract
Кластер регулярно межпространственных коротких палиндромных повторов (CRISPR)/CRISPR-ассоциированный белок 9 (Cas9) является методом редактирования генов, широко используемым в исследованиях функции генов. Мы используем этот метод в этом исследовании, чтобы проверить на специфику антител, разработанных против насекомого ГАМКрецептора субъединицы Сопротивление диелдрина (RDL) и метаботропных глутаматрецептора mGlutR1 (mGluRA). Антитела были созданы в кроликов против конъюгированных пептидов, характерных для плодовых мушек (Drosophila melanogaster), а также медоносных пчел (Apis mellifera). Мы использовали эти антитела в секциях мозга медоносных пчел для изучения распределения рецепторов в мозге медоносных пчел. Антитела были сродство очищены от пептида и протестированы с иммуноблоттингом и классический метод preadsorption с пептидками конъюгированных, чтобы показать, что антитела специфичны для соответствующих пептида конъюгированных против которых они были подняты. Здесь мы разработали метод CRISPR-Cas9 для проверки на снижение белковых целей в мозге 48 ч после инъекции CRISPR-Cas9 с направляющими РНК, предназначенными для соответствующего рецептора. Метод CRISPR-Cas9 также может быть использован в поведенческом анализе у взрослых пчел, когда один или несколько генов должны быть изменены.
Introduction
Недавно обнаруженная система CRISPR/Cas9 является мощным инструментом, который был использован для изменения геномной ДНК в различных модельных системах и организмах. Он ускорил биомедицинские исследования и крупные технологические прорывы, сделав модификацию генома более эффективной и надежной, чем предыдущие методы1. Родом из бактерий S. pyogenes, система опирается на эндонуклеазы Cas9, чья активность приводит к двухцепочечным перерывам (DSBs) в ДНК, и руководство РНК (gRNA), который направляет белок Cas9 в конкретное, последовательно-зависимое место2. Двухцепочечные перерывы, генерируемые CRISPR/Cas9, могут быть устранены с помощью негомологического конца присоединения (NHEJ), процесса, подверженного ошибкам, который может привести к смещению кадров, или непосредственному ремонту гомологии при присутствующем донорском шаблоне. Сама gRNA состоит из целевой CRISPR РНК (crRNA) и универсальной трансактивационной crRNA (tracrRNA), которая может быть химически синтезирована и доставлена с очищенной нуклеаза Cas9 как рибонуклеопротеин комплекс (RNP)2,3. Флуоресцентная маркировка gRNA или Cas9 nuclease может позволить для обнаружения и внутриклеточной визуализации молекулярных компонентов с помощью флуоресцентной микроскопии4.
В нашей нынешней работе мы пользуемся системой CRISPR-Cas9 для снижения уровня белка в мозге пчел взрослых. Мы изучили метаботропные рецепторы глутамата (mGluR) и анти-mGlutR1 рецепторов антител иGABA рецепторов субъединицы RDL и анти-RDL антител. Мы разработали простой метод для уменьшения количества белка в мозге взрослой пчелы и использовали его для проведения дополнительных тестов антител, разработанных против соответствующих белков. Мониторинг флуоресценции CRISPR-Cas9 позволил нам оценить области и клетки, участвующие в сокращении белка.
Используя этот метод, мы также охарактеризовали анти-mGlutR1 антитела, которые были сделаны в кроликов против конъюгированного пептида. Геном пчел кодирует высоко консервированный AmGluRA (названный mGlutR1 в соответствии с номенклатурой NCBI) метаботропный рецептор глутамата5. Ген медоносной пчелы mGlutR1 имеет четыре прогнозируемых варианта сращивания в соответствии с базой данных NCBI. Сообщалось, что он выражается в центральной нервной системе (ЦНС) как pupal и взрослых пчел этапов и он участвует в долгосрочной памяти формирования5. Антитела, разработанные против mGlutR1, могут быть важным инструментом для изучения глутаматергической системы в процессе обучения и памяти медоносных пчел.
В наших исследованиях мы также охарактеризовали анти-RDL антитела, разработанные у кроликов, привитых с конъюгированными пептидами из субъединицы рецепторов Apis mellifera RDL. Ген медоносной пчелы Rdl, AmRdl (XM_006565102.3, база данных NCBI), имеет 14 прогнозируемых вариантов сращивания. Частично клонированный фрагмент был зарегистрирован в базе данных NCBI AF094822.1. Функция рецепторов RDL и его физиология хорошо изучены у насекомых6,7,8,в том числе пчел9,10,11. Антитела, разработанные против анти-RDL может быть важным инструментом для изучения ГАМК-системы в процессе обучения и памяти в медоносных пчел.
Более раннее исследование о роли осьминога и рецепторов тирамина использовали РНК вводили в мозг с последующим испытанием количества белка Западной помок12,13. Тем не менее, РНК имеет некоторые значительные ограничения. Существует только короткое время после инъекции РНК, в течение которого сокращение белка происходит13. CRISPR-Cas9 был использован совсем недавно в эмбрионах медоносных пчел, чтобы удалить или изменить гены в целом животных14,15,16. Мы сообщили об использовании CRISPR-Cas9 для уменьшения количества белка во взрослой пчеле. Мы разработали этот подход для медоносных пчел из-за способности соединить его с поведенческими исследованиями обучения и памяти в контролируемых лабораторных условиях17.
В настоящей работе мы разработали антитела против двух рецепторов и протестировали их на взрослых секциях мозга медоносных пчел после того, как белок был уменьшен путем инъекции CRISPR-Cas9. В то же время мы разработали экспериментальную конструкцию, которая позволяет использовать метод для поведенческих экспериментов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Характеристика анти-RDL и анти-mGlutR1
Во-первых, мы охарактеризовали анти-RDL и анти-mGlutR1 антител иммуноблота и предварительноадсорбции на ломтики фиксированной медоносных пчел мозга. Каждое антитело было сделано, чтобы распознать все его известные изоформы, и западный анализ показывает, что они распознают полосы, которые соответствуют их предсказанным молекулярным весам. Затем оба антитела были заблокированы конъюгированным пептидом, против которого они были произведены на участках мозга медоносных пчел.
Одной из первых целей в нашем исследовании было установить, что антитела, вырабатываемые против специфического спряженого пептида, специфичны для его белка в фиксированной ткани мозга. Для этого мы воспользовались системой CRISPR-Cas9. Мы разработали специальные направляющие для медоносных пчел RDL и mGlutR1 и использовали каждый из них, чтобы сделать CRISPR-Cas9 помечены флуоресцентным зондом ATTO550. Для каждого рецептора, мы вводили смесь из трех различных CRISPR-Cas9 рибонуклеопротеинов в окелли, чтобы уменьшить количество целевого белка в мозге пчел взрослых, устраняя соответствующий ген в клетках, которые заняли нашу разработанную систему Cas9. В нашем исследовании мы сделали этот шаг.
Одним из первых важных шагов для успеха этих экспериментов является разработка соответствующего руководства РНК. Мы рекомендуем проектировать до пяти направляющих РНК, расположенных в начале, середине и конце последовательности генов. В нашей предварительной работе мы тестировали их в различных комбинациях на трех-пяти пчелах. Мы также пробовали различные концентрации инъекций, а также раз после инъекции, и различные смеси РНП в инъекциях. Мы расчленили мозги и обработали их анти-RDL и анти-mGlutR1 антителами. В этих первоначальных тестах мы установили соответствующую комбинацию, время после инъекции, а также концентрацию и количество CRISPR-Cas9 для инъекций. Эти первоначальные испытания были основой для создания экспериментов, которые мы подробно описали здесь.
Цель была в два раза: 1) чтобы продемонстрировать в пчеле, что наши антитела окрашивания была сокращена после лечения с CRISPR-Cas9 и 2) для работы через лучшие экспериментальные условия для поведенческих исследований. Таким образом, мы показываем, что если многие ядра клеток содержат CRISPR-Cas9 48 h после инъекции, то уменьшение окрашивания анти-РДЛ и анти-мГлютр1 является значительным. Кроме того, это свидетельствует о том, что проверенные антитела специально распознают белок mGlut1 и RDL в подготовке мозга медоносных пчел и что они могут быть использованы для локализации исследований в мозге медоносных пчел.
Экспериментальная настройка CRISPR-Cas9 для поведенческого исследования
Далее мы настроили эксперименты так, чтобы CRISPR-Cas9 можно было использовать в поведенческих исследованиях. Восемь или девять медоносных пчел были собраны для контроля и экспериментального лечения. Они были поведенчески протестированы до и после инъекции, а затем их мозг был обработан для ATTO550 и / или иммуноцитохимии для определения областей мозга, которые показали сокращение целевого белка. Здесь важно отметить, что количество пчел, взятых для одного набора экспериментов, было ограничено не более 8-9 пчел для контрольно-экспериментальных условий. Таким образом, оба условия могут быть проверены в тот же день. Кроме того, как только мы подготовили crispR-Cas9 смеси для инъекций, мы никогда не заморозили их. Смесь CRISPR-Cas9 не изменялась в потенции при использовании 3 дня подряд и хранилась при 4-8 градусах Цельсия. Тем не менее, мы не проверяли его через 3 дня.
Как мы описали в разделе Результаты для обоих наборов экспериментальных инъекций и для обоих антител, только три пчелы из 16 испытания показали большое распределение ATTO550 в корпусе грибов, протоцеребрум, и антенные доли. Во всех других пчел, распределение CRISPR-Cas9 был ограничен гриб тела, центральный комплекс, и / или задний protocerebrum. Важно понимать для любых поведенческих исследований, что с помощью этого метода инъекций сокращение целевого белка будет ограничено только грибного тела в большинстве пчел. Он не будет распространяться на антенны ели или субэзофагеальный ганглия. Таким образом, метод инъекций, который мы используем подходит для изучения влияния сокращения рецепторов в организме гриба и центрального комплекса в поведенческих экспериментах, в то время как другой метод введения CRISPR-Cas9 будет более подходящим для изучения других областей мозга.
В заключение наше исследование показало успешное применение CRISPR-Cas9 в качестве контроля для окрашивания антител в мозге. Для обоих антител (анти-RDL и anti-mGlutR1), когда поглощение mGlutR1-CRISPR-Cas9 или RDL-CRISPR-Cas9 было успешно, уровень соответствующего окрашивания антител также был снижен. Также важно отметить, что инъекция в окелли привела к распространению CRISPR-Cas9 в головном мозге, который не был однородным. Распределение варьировалось от минимальной области, окружающей тело окелли и грибов, до многих клеток всего мозга. Вариабельность поглощения mGlutR1-или RDL-CRISPR-Cas9 клетками, вероятно, была обусловлена изменениями в инъекциях. Наши данные показывают, что система CRISPR-Cas9 работает в медоносных пчелах, но метод инъекций необходимо улучшить, чтобы уменьшить изменчивость поглощения CRISPR-Cas9 в отдельных мозгах пчел. В рамках этих ограничений, теперь можно использовать этот метод для манипулирования генами у взрослых пчел для поведенческих экспериментов.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана следующими наградами BHS: Human Frontiers Science Program; NIH NIGMS (R01 GM113967); NsF Ideas Lab (1556337). Пептид и антитела для DmGluRA были разработаны в лаборатории доктора Сержа Бирмана (Марсель, Люмини, Франция), когда IS была поддержана Программой d’Urgence FRM/Postdocs UFP20060306548 от Фонда за решерше Medicale. Мы благодарны Даниэле Junqueira Мароши и Алекс Уэнтер из комплексной технологии ДНК (IDT) за помощь в разработке RDL-гидов и анализов высадки qPCR.
Materials
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283_100 mL | western blotting |
| Acrylamide-bis Acrylamide | Bio-Rad | 500 mL 1610156 | western blotting |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A0169-250g | used with distilled water to fix honey bee brain in blocks |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Research Laboratories | 711-546-152 | secondary antibody to reveal the primary antibodies from rabbit |
| Alt-R CRISPR-cas9 tracrRNA-5'ATTO | IDT | 1075934 | with desinged guide RNA, it creates gRNA |
| Alt-R S.p. Cas9 nuclease V3 | IDT | 1081058 | enzyme used to make ribonucleoprotein for CRISPR system |
| Ammonium Persulfate | Bio-RAD | 10 g 1610700 | western blotting |
| Anti-mGlutR1 antibodies | Covalab (FRANCE)/21st Century Biochemical | characterized by authors in present paper | Used for primary incubation of mGlut 1 in honey bees |
| Anti-RDL antibodies | 21st Century Biochemical | characterized by authors in present paper | Used for primary incubation of RDL in honey bees |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | Y0001154 | protease inhibitor |
| Barraquer Iris Scissors 7mm Blade Sharp point | World Precision Instruments | 14128-G | used for dissection honey bee brain |
| Benzamidine | Sigma-Aldrich | 12072 | protease inhibitor |
| Blade (breakable) for blade holder | Fine Science Tool | 10050-00 | dissection for western blotting |
| Blade holder and breaker | Fine Science Tool | 15309 | dissection for western blotting |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100 F | for injection procedure |
| Chemiluminescent western blot detection substrate | Bio-Rad | 1705062 | western blotting |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 472476-50mL | RNA isolation |
| Dithiothreitol | Bio-Rad | 1610611 | western blotting |
| DNA easy kit | QIAGEN | 69504 | DNA extractionuj |
| DNA-free kit | INVITROGEN | AM1907 | Used to remove DNA |
| Eppendorf Research plus pipette, 3-pack | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
| Falcon 24 Well Polystyrene Multiwell | Falcon | 351147 | Multiwell |
| Flat Bottom Embedding Capsules, Polyethylene | Electron Microscopy Science | 70021 | basket for brain sections |
| Forceps Dumont #5 (pair) | Fine Science Tool | 11254-20 | for dissection of honey bee brain from the head |
| Forceps Dumont #5S (pair) | Fine Science Tool | 11252-00 | to clean up the brain from trachea befor dissection |
| Gene Expression Master Mix | Integrated DNA Technologies | 1055770 | qPCR drop off assay |
| Glutaraldehyde | EMS | 16220 | used for preparation of peptide conjugates for control peabsorption |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500 mL | western blotting, embedding media |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | western blotting |
| Hydrophobic filtered nylonmesh | Spectrum Labs | 145910 | for bottom of basket for brain sections |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-50mL | RNA isolation |
| Keyhole limpet hemocyanin | Sigma-Aldrich | H7017 | used for preparation of conjugates for control |
| LSM800 cofocal microscope | Zeiss | ||
| mGlu_Guide 1 | IDT | designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences | |
| mGlu_Guide 2 | IDT | designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences | |
| mGlu_Guide 3 | IDT | designed guide RNA for CRISPR. Target mGlutR1 genome sequences | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | western blotting |
| 96-well PCR microplate | Applied biosystem | 4346907 | qPCR drop off assay and qRT-PCR |
| 384-well PCR microplate | Sigma-Aldrich | Z374911 | qRT-PCR |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904_500mL | for injection procedure |
| Model p87 Flaming Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Capillary Preparation | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | for embedding solution |
| Nanoliter 2000 | World Precision Instruments Nanoliter | Injection Apparatus | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Research Laboratories | AB_2337258 | blocking agent for immunocytochemistry |
| Non-immune Goat Serum | Invitrogen | 50-062Z 100 mL | blocking agent for immunoblotting |
| Nuclease-free buffer | IDT | 1072570 | Nuclease-free buffer that is used in the preparation of CRISPR-Cas9 injection |
| Nuclease-free water | IDT | AM9337 | nuclease -free water that is used in preparation of CRISPR-Cas 9 system |
| OrbitalShaker Mp4 | Genemate | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500 g | used with PBS to make fixative for bee brains |
| Phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626-250 mg | protease inhibitor |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | Used with Paraformaldehyde as fixative; buffer for antibodies |
References
- Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current Protocols in Human Genetics. 83 (15), 7-27 (2014).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Kouranova, E., et al. CRISPRs for Optimal Targeting: Delivery of CRISPR Components as DNA, RNA, and Protein into Cultured Cells and Single-Cell Embryos. Human Gene Therapy. 27 (6), 464-475 (2016).
- Schubert, M., et al. Fluorescently labeled tracrRNA provides efficient genome editing while allowing cellular microscopy and FACS analysis. Genome Editing. , 1-3 (2017).
- Kucharski, R., Mitri, C., Grau, Y., Maleszka, R. Characterization of a metabotropic glutamate receptor in the honeybee (Apis mellifera): implications for memory formation. Invertebrate Neuroscience. 7 (2), 99-108 (2007).
- Aronstein, K., Auld, V., Ffrench-Constant, R. Distribution of two GABA receptor-like subunits in the Drosophila CNS. Invertebrate Neuroscience. 2 (2), 115-120 (1996).
- Thompson, M., Steichen, J. C., ffrench-Constant, R. H. Conservation of cyclodiene insecticide resistance-associated mutations in insects. Insect Molecular Biology. 2 (3), 149-154 (1993).
- Chung, B. Y., Kilman, V. L., Keath, J. R., Pitman, J. L., Allada, R. The GABA(A) receptor RDL acts in peptidergic PDF neurons to promote sleep in Drosophila. Current Biology. 19 (5), 386-390 (2009).
- Taylor-Wells, J., Hawkins, J., Colombo, C., Bermudez, I., Jones, A. K. Cloning and functional expression of intracellular loop variants of the honeybee (Apis mellifera) RDL GABA receptor. Neurotoxicology. 60, 207-213 (2017).
- Jones, A. K., Sattelle, D. B. The cys-loop ligand-gated ion channel superfamily of the honeybee, Apis mellifera. Invertebrate Neuroscience. 6 (3), 123-132 (2006).
- Dupuis, J. P., et al. Homomeric RDL and heteromeric RDL/LCCH3 GABA receptors in the honeybee antennal lobes: two candidates for inhibitory transmission in olfactory processing. Journal of Neurophysiology. 103 (1), 458-468 (2010).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).
- Guo, X., Wang, Y., Sinakevitch, I., Lei, H., Smith, B. H. Comparison of RNAi knockdown effect of tyramine receptor 1 induced by dsRNA and siRNA in brains of the honeybee, Apis mellifera. Journal of Insect Physiology. 111, 47-52 (2018).
- Roth, A., et al. A genetic switch for worker nutrition-mediated traits in honeybees. PLOS Biology. 17 (3), e3000171 (2019).
- Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. Production of Knockout Mutants by CRISPR/Cas9 in the European Honeybee, Apis mellifera L. Zoological Science (BIOONE). 33 (5), 505-512 (2016).
- Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. High-Efficiency CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing in Honeybee Apis mellifera Embryos. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).
- Smith, B. H., Burden, C. M. A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research. Journal of Visualized Experiments. (91), e51057 (2014).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Rodriguez, J., Deinhardt, F. Preparation of a semipermanent mounting medium for fluorescent antibody studies. Virology. 12, 316-317 (1960).
- . Custom Alt-R® CRISPR-Cas9 guide RNA Available from: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM (2019)
- Bonnafe, E., et al. Effect of a thymol application on olfactory memory and gene expression levels in the brain of the honeybee Apis mellifera. Environmental Science and Pollutant Research (International). 22 (11), 8022-8030 (2015).
- Wang, Y., et al. Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honeybee ovaries. Journal of Experimental Biology. 215 (Pt 1), 124-134 (2012).
