Anti-RDL ו Anti-mGlutR1 קולטנים נוגדן בדיקות בסעיפים המוח הונאיבי באמצעות CRISPR-Cas9
Summary
מוצג כאן הוא פרוטוקול להשתמש במערכת CRISPR-Cas9 להפחתת הייצור של חלבון במוח דבורת דבש למבוגרים כדי לבדוק ספציפיות נוגדנים.
Abstract
האשכול באופן קבוע במרווחים של Palindromic משולבת חוזר (CRISPR)/קריספר-חלבון משויך 9 (Cas9) היא טכניקת עריכת גנים בשימוש נרחב במחקרים של פונקציית גנים. אנו משתמשים בשיטה זו במחקר זה כדי לבדוק את הספציפיות של נוגדנים שפותחו נגד החרקנגבה עמידות יחידת לקולטן dieldrin (rdl) ו הקולטן גלוטמט מטבוטרופי mGlutR1 (mglura). הנוגדנים נוצרו בארנבים נגד הפפטידים המצובבים הספציפיים לזבובי פירות (דרוסופילה מלאנוסטר), כמו גם לדבורי דבש (מחלתapi). ללמוד את התפלגות הקולטנים. במוח שבדבורת הדבש הנוגדנים היו אהדה מטוהרים על הפפטיד ונבדק עם החיסונית ואת השיטה הקלאסית של preadsorption עם שערי מעלה פפטיד להראות כי הנוגדנים הם ספציפיים המקבילה פפטיד השערים שנגדם הם גדלו. כאן פיתחנו את הטכניקה CRISPR-Cas9 כדי לבדוק את הפחתת מטרות החלבון במוח 48 h לאחר CRISPR-Cas9 הזרקה עם RNAs מדריך מיועד קולטן המקביל. השיטה CRISPR-Cas9 יכול לשמש גם ניתוח התנהגותי בדבורים מבוגרים כאשר אחד או גנים מרובים צריך להיות שונה.
Introduction
המערכת האחרונה שהתגלו CRISPR/Cas9 הוא כלי רב עוצמה ששימש לשנות דנ א גנומית במערכות מודל שונות ואורגניזמים. זה האיץ מחקר ביו ופריצות דרך טכנולוגיות גדולות על ידי הפיכת שינוי הגנום יעיל יותר וחזק יותר שיטות קודמות1. יליד לחיידק S. pyogenes , המערכת מסתמך על Cas9 endonuclease, אשר פעילות מובילה כפול תקועים הפסקות (dsbs) ב-DNA, ו-RNA מדריך (grna) המכוון את חלבון Cas9 למיקום ספציפי, תלוי רצף2. כפול תקועים הפסקות שנוצרו על ידי CRISPR/Cas9 ניתן לתקן באמצעות שאינם הומוולוגי הצטרפות (NHEJ), תהליך נוטה לטעויות שיכול להוביל לframeshifts, או לתקן הומולוגיה ישירה כאשר תבנית התורם נוכחת. Grna עצמו מורכב היעד ספציפי crispr RNA (crrna) ו-ההפעלה האוניברסלית הפעלה crrna (tracrrna) אשר יכול להיות מסונתז כימית ונמסר עם מטוהרים Cas9 נוקלאז כקומפלקס ribonucleoprotein (rnp)2,3. תיוג פלורסנט של grna או Cas9 נוקלאז יכול לאפשר זיהוי והדמיה תאיים של רכיבים מולקולריים באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט4.
בעבודה הנוכחית שלנו, אנו לנצל את מערכת CRISPR-Cas9 כדי להפחית את רמות החלבון במוח הונאיבי מבוגרים. למדנו את קולטן גלוטמט מטבוליזם (mGluR) ו anti-mGlutR1 נוגדנים לקולטן ואת הנגבהמשנה קולטן rdl ונוגדנים ANTI-rdl. פיתחנו שיטה פשוטה כדי להפחית את כמות החלבון במוחו של דבורת הדבש המבוגר והשתמשו בו כדי לנהוג בדיקות נוספות של הנוגדנים שפותחו נגד החלבונים המתאימים. ניטור הזריחה של CRISPR-Cas9 אפשרה לנו להעריך את האזורים והתאים המעורבים בהפחתת החלבון.
באמצעות שיטה זו, האפיינו גם את הנוגדנים נגד mGlutR1 שנעשו בארנבים נגד הפפטיד הצוממה. הגנום דבורת הדבש מקודד AmGluRA שימור מאוד (בשם mGlutR1 על פי המינוח NCBI) מטבוטרופי קולטן מטבוליזם5. MGlutR1 גן דבורת הדבש יש ארבעה מחזויים באמצעות מאגר הנתונים של ה-NCBI. זה דווח כי הוא מתבטא במערכת העצבים המרכזית (cn) של שני גולמי ושלבי הדבורים מבוגרים והוא מעורב במערך הזיכרון לטווח ארוך5. נוגדנים שפותחו נגד mGlutR1 יכול להיות כלי חיוני ללימוד מערכת glutamatergic בתהליך הלמידה והזיכרון בדבורי דבש.
במחקרים שלנו, אנו מאופיין גם נוגדנים anti-RDL שפותחו ארנבים החיסון עם פפטידים מצוחזים מתוך משנה api מעלה קולטן rdl. את גן דבורת הדבש, amrdl (XM_006565102 .3, מסד נתונים ncbi), יש 14 ממתמרים חזויים. מקטע משוכפל חלקי דווח במסד הנתונים של NCBI ק AF 094822.1. פונקציית הקולטן rdl והפיזיולוגיה שלה הוא למד היטב חרקים6,7,8, כולל הדבורים9,10,11. נוגדנים שפותחו נגד anti-RDL יכול להיות כלי חיוני ללימוד מערכת GABAergic בתהליך הלמידה והזיכרון בדבורי דבש.
מחקר מוקדם יותר על התפקיד של הקולטנים של אוקטואמין ו tyramine בשימוש rnai מוזרק לתוך המוח בבדיקה הבאה של כמות החלבון על ידי כתמי מערבי12,13. עם זאת, RNAi יש כמה מגבלות משמעותיות. יש רק חלון זמן קצר לאחר הזרקת RNAi שבה הפחתת החלבון מתרחשת13. Crispr-Cas9 שימש לאחרונה בעוברי דבורת דבש כדי למחוק או לשנות את הגנים של החיה כולה14,15,16. אנו דיווחו על השימוש CRISPR-Cas9 כדי להפחית את כמות החלבון של דבורת הדבש המבוגר. פיתחנו את הגישה הזאת לדבורי דבש בשל היכולת לבני זוג ללימודים התנהגותיים של למידה וזיכרון תחת תנאי מעבדה מבוקרים17.
בעבודה הנוכחית, פיתחנו נוגדנים נגד שני קולטנים ובחנו אותם על מקטעים המוח בוגרים דבורת הדבש לאחר הופחת החלבון על ידי הזרקת CRISPR-Cas9. יחד עם זאת, הקמנו תכנון ניסיוני המאפשר שימוש בשיטה לניסויים התנהגותיים.
Protocol
הפרוטוקול המתואר כאן עוקב אחר ההנחיות לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת אריזונה סטייט. 1. חלבון מוחלט בידוד ממוח של ממשקי api הערה: השתמש בממשקי api חדשים של טורפים בעולם החדש בעידן לא ידוע לניסוי זה. הניחו את מסך רשת האלומיניום מעל הכניסה לכוורת כדי ללכוד את דבורי הדבורים17. ללכוד כל דבורה בבקבוקון עם חור קטן בכל כובע. מניחים את הבקבוקונים המכילים את הדבורים בקרח כדי להנמיך את טמפרטורת הגוף שלהם ולשתק אותם. להשאיר את הדבורים בקרח במשך לא יותר מ 3 דקות. אבטח את הדבורים לתוך מחזיקי מתכת שהוכנו בעבר. ודא שמחזיקי המתכת בנויים כך שניתן יהיה לאבטח את הדבורה עם פיסות נייר קטנות, אך עדיין יש לו את החזה האחורי, הכנפיים והראש חשופים.התראה: ודא כי הדבורים הם מלאים לחלוטין לפני שמנסים למקם אותם במחזיקי. להאכיל את הדבורים עם פתרון 1 מ ‘ סוכות באמצעות מזרק 5 מ ל עד שהם כבר לא רעבים. מניחים את הדבורים מאובטח בקופסה עם מגבת נייר רטוב כדי להבטיח סביבה לח. לנתח את המוח של הדבורה במהירות על ידי גזירת הראש עם מספריים איריס האוצר (ראה שולחן החומרים) ולהשתמש במספריים כדי לפתוח את הראש מהחזית. לחתוך את המוח מתוך קפסולת הראש, לקחת את המוח עם מלקחיים #5, ולמקם אותו ב 100 μL של קר (4-8 ° c) מאגר לפירוק. מאגר הליזה מורכב מ-120 מילימטר טריס-HCl, 2% נתרן dodecyl סולפט (SDS), 5% גליצרול, 0.2 מ”מ מילימטר, 1% טריטון X-100, ו 1-5 μg/mL של מעכבי הפרוטאז PMSF (פנילמתיל), אספנין, בנזיל (pH 6.8) ב -4 ° c. המגון להפוך את המוח בפתרון הליזה על ידי הפיכת הפסל במשך כ 2 דקות. צנטריפוגה את המדגם ב 12,000 x g עבור 20 דקות. משוף 90 μl של סופרנטאנט ולהשליך את הגלולה. קח 1 μL של סופרנטאנט כדי לכמת את החלבון הכולל באמצעות פלואורימטר. הריכוז המשוער של החלבון הכולל היה בין 2-3 mg/mL לכל דבורה. קח 10 μL של supernatant ולהוסיף 10 μL של מאגר הליזה 10 μL של מאגר 6x Laemmli18. ספין קצר ומרתיחים למשך 3 דקות, ואז להתקרר על הקרח. ספין עבור 1 דקות ב 10,000 x g כדי להסיר את כל ההריסות. עשירית ממוח הדבורים מכיל כ -25 אלף חלבון מוחלט. 2. בלוק מערבי19 להפוך 30 מ ל 10% ג’ל פועל המכיל 12.15 mL של מים מזוקקים אלקטרופורזה, 7.5 מ ל של 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8), 0.3 mL של 10% sds, 10 מ ל 30% אקרילאמיד-bis אקרילאמיד הפתרון, 0.15 ml של 10% אמוניום פרסולפט (APS), ו 20 μl של טטרמתילתימיה (temed ). השליכו את הג בין שתי צלחות זכוכית המופרדות על ידי מרווחים. הפוך ג’ל לערימה של 20 מ ל המכיל 12.1 מ ל של מים מזוקקים באולטרטהור, 5.0 mL של 0.5 M טריס-HCl (pH 6.8), 0.2 mL של 10% SDS, 2.6 mL של אקריל-bis, 0.1 mL של 10% APS, ו 20 μL של TEMED. כאשר ג’ל הריצה מתקשה לשפוך ג’ל לערימה. בזהירות להוסיף את מפריד פלסטיק להטיל את נתיב הטעינה, הימנעות בועות. , חכו 15-30 דקות. עד שהג מתחזק התחל להעמיס את הג באמצעות 5 μL של תקני חלבון. טען 20 μL של תערובת ליפוסט משלב 1.8 למסלול, המתאים ~ 1/15 של מוח דבורה או ~ 16 ng של חלבון מוחלט למסלול. הפעל את הדגימות עבור סך של 3.5-4 הכולל ב 16 mA ב-ג’ל לערום ו 32 mA ב ג’ל ריצה. . עצור כשהצבע עוזב את הג העבר את החלבונים אל הממברנות תאית במאגר העברה (25 מ”מ Tris-HCl, 192 מ”מ גליצין, 15% מתנול) ב 0.45 mA עבור 1 h 30 דקות ב 4 ° c. כדי להעריך את היעילות של העברת החלבון בעקבות SDS-PAGE לפני החיסונית, להוסיף את הפתרון הכתמים של פוננסו S (להוסיף 0.1 g של פוננסו S ו 5 מ ל של חומצה אצטית למים לנפח הסופי של 100 mL). חנות ב 4 ° צ’ עבור 1 דקות ולשטוף במהירות עם מים מזוקקים. התווית כל נתיב עם עט כדורי, לחתוך את הקרום המכיל שני נתיבים עם הומוגון המוח ונתיב אחד עם סמן החלבון ומקום כל אחד בתיבה מערבית כתם אבן. לרחוץ את 3x עבור 5 דקות כל אחד מלוחים באגירה פוספט (PBS) המכיל 0.1% יצירת רצף 20 (PBS-Tw). לחסום את הקרום עם 10% NGS (1 מ ל של סרום עז רגיל ל 10 מ ל של PBS-Tw) בתיבת הדגירה כתם מערבי של 1 h. הפוך את דילול anti-mGlutR1 (5 μL של נוגדן ב 10 מ ל של 10% NGS). להפוך את האנטי RDL1 ואת anti-RDL2 מדלל (5 μL של נוגדן ב 10 מ ל של 10% NGS כל אחד). החלף את פתרון חסימת בכל תיבה עם נוגדנים מדולל ולעזוב לילה (16-24 h) ב 4 ° c. לשטוף את ממברנה 3x עבור 5 דקות כל אחד ב-PBS-Tw. הממברנה ממברנה עם אנטי ארנב IgG מצוב-נוגדנים משניים ב 1:10000 ב 10% NGS PBS-Tw עבור 2 h בטמפרטורת החדר (RT). , שטוף את ממברנות 3 x בערוץ הPBS. ואז 1x בערוץ הpbs לאתר את הלהקות באמצעות המצע המערבי של הכמקיומינטאניאור. מערבבים שני מצעים 1:1 (v/v) ב RT, לשים את כל הקרומים באותה תיבה ולכסות אותם עם תערובת מצע עבור 2 דקות (בחדר חשוך עם אור אדום) ב RT. המשך לגילוי חלבונים באמצעות סרט האדיגרפיה האוטומטי עם מספר פעמים חשיפה. בדרך כלל נוגדן אחד נבדק על קרום אחד המכיל את הדילול אותו של הומוגון המוח לאכול על שניים או שלושה נתיבים ונתיב אחד עם סמן משקל. 3. הליכים אימונוסוציכימיים ולשתק את הדבורים בקרח. במשך 30 ס מ לאחר הדבורים מקיבוע, לערוף את הדבורה עם מספריים ולמקם את הראש בתמיסה של 4% פאראפורמלדהיד ב-PBS. . תעבוד מתחת למכסה המנועהתראה: על הגוף להיות מסולק בזהירות משום שהבטן עדיין יכולה לעקוץ לאחר עריפת הראש. בזהירות אבל להסיר במהירות את האנטנות, העיניים מורכבים, ולחתוך בכל רחבי שלד חיצוני העליון עם מספריים בראוצר איריס. הרשו לראשים לשבת בתמיסה האקסוטיבית במשך 10 דקות. הסירו את שאר השלד החיצוני של הראש וחתכו את כל הגרמות הנותרות. מניחים כל מוח בצינור 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה המכיל לפחות 1 מ ל של 4% הפתרון פאראפורמלדהיד ולעזוב את הלילה ב 4-8 ° c. הפוך את הפתרון 7.6% agarose על ידי ערבוב 3.8 g של agarose ו 50 mL של מים מזוקקים בבקבוקון Erlenmeyer אייר. מיקרוגל את הפתרון עד העלה מעלה.הערה: ניתן להניח פיסת נייר קטנה בפתח הבקבוקון כדי למנוע את התמיסה העולה מוצפת במהלך החימום. מניחים את המוח הונאיבי קבוע (3-4 מוחות) ב-35 מ”מ צלחת פטרי ולהסיר את עודף קבע עם נייר טישו. יוצקים את הפתרון הנוזלי הנוזל על המוח. כוון את המוח בתוך העלה כך את האונות האנטנה פונים כלפי מעלה. הרשו לאגקם להתקרר ולגבש. לאחר הצמח התחזק, לגזור בלוקים של מתעורר כל אחד המכיל מוח. לצורך התאמת הרטט, הכינו צלחת של 24 שעות עם כל הבאר המכילה סל עם רשת הידרופובי בתחתית. מלא כל טוב עם 600 μL של PBS. חותכים כל בלוק לתוך 70 יקרומטר לחצות סעיפים באמצעות מכונת הרטט ומניחים את הסעיפים בסל המכיל PBS.הערה: ודא שמקטעים מאותו מוח מוצבים בסל זהה. לשטוף את מקטעי המוח 6x עבור 10 דקות כל אחד עם PBS-TX כדי להבטיח כי אין שרידים קבע בסעיפים. מניחים את הצלחת multiwell יטב על שייקר מסלולית ולשטוף את המוח ב 210 סל ד. לפני כל כביסה להיות בטוח להחליף את הפתרון PBS-TX עם פתרון PBS-TX טרי. בלוק עם 1% סרום חמור רגיל במהלך השטיפה האחרונה. כדי לבדוק את הנוגדן הראשוני anti-mGlutR1, להכין דילול 1:112 של נוגדנים anti-mGlutR1 על ידי הוספת 9 מ ל של PBS-TX ל 80 μL של אנטי mGlutR1 נוגדנים בתוך שפופרת צנטריפוגה 15 מ”ל. מערבולת הצינור לזמן קצר לערבב ביסודיות. דילול העבודה של הנוגדנים נקבע בניסויים ראשוניים. כדי לבדוק את הנוגדן הראשי anti-RDL, להכין דילול 1:100 של נוגדנים anti-RDL על ידי הוספת 30 μL של פפטיד anti-RDL 1, 30 μL של פפטיד anti-RDL 2, ו 6 מ ל של PBS-TX ב 15 מ ל זונדה צנטריפוגה. מערבולת הצינור לזמן קצר לערבב ביסודיות. דילול העבודה של הנוגדנים נקבע בניסויים ראשוניים. הוסף 800 μL של פתרון נוגדן לכל טוב בצלחת. לכסות את הצלחת multiwell יטב ולעטוף אותו רדיד אלומיניום כדי למנוע השפלה מפני חשיפה לאור. מניחים את הצלחת עטוף רדיד אלומיניום על שייקר מסלולית ולנער ב 210 rpm עבור 2 h. ואז לעזוב את הלילה ב-RT בלי לרעוד. לאחר שחלקי המוח נותרו בתוך הלילה, לשטוף עם PBS-TX במשך 10 דקות. חזור על שטיפת השלב 6x. הכינו את הנוגדנים המשניים (אנטי ארנבת מהחמור) על ידי ביצוע דילול 1:225 של נוגדנים משניים על ידי הוספת 40 μL של נוגדנים משני ל 9 מ ל של PBS-TX. הוסף 800 μL של הנוגדן המשני לדילול כל טוב. כסו את הצלחת ועטפו אותו ברדיד אלומיניום. מניחים את הצלחת עטוף רדיד אלומיניום על שייקר מסלולית ולנער ב 210 rpm עבור 2 h. ואז להשאיר אותו בלילה בשעה. לשטוף את המוח סעיפים 3 x עבור 10 דקות כל אחד עם PBS-TX ו-3x עם פתרון PBS רגיל. להטבעת המקטעים בשקופיות, הכינו את התמיסה המתקנת מדיה/גליצרול שהשתנתה מרודריגז et al.20. הוסף 5 גרם של המדיום ההרכבה ב 20 מ”ל PBS ומערבבים 16 h עם מערבב מגנטי. מוסיפים 10 מ ל של גליצרול ומערבבים לעוד 16 שעות עם מערבב מגנטי. צנטריפוגה עבור 15 דקות ב 4,000 x g, לקחת את הנוזל הומוגנית על-גבי נוזלי, ו-סדרת מחלקים ב 1 שפופרות mL. המשך-20 ° צ’ הטבע את המקטעים על השקופיות עם טיפת מדיום ההרכבה שהוכנה בשלב 3.17, וודא שכל שקופית מכילה מקטעים ממוח אחד. שליטה מראש של כתמים חיסוני עם פפטידים מצוקדים עבור anti-RDL ופפטידים מצובית, מודחלת את דילול העבודה של נוגדנים anti-RDL עם המשלים פפטיד המקביל לילה ב RT על שייקר: מצב 1) 500 μg פפטיד מצועם מפתח לימפט הומוציטומין (KLH) דרך גלוטרלדהיד; מצב 2) ללא המשלים. צנטריפוגה כל תערובת עבור 10 דקות ב 10,000 x g ולאסוף את supernatant משני התנאים (שלב 3.19.1). מודלת את הסעיפים הסידוריים של מוח דבורת דבש עם כל supernatant ותהליך עם נוגדנים משניים שתוארו לעיל. מקטעים טוריים הם מקטעים העוקבים זה אחר זה במהלך הליכי הרטט, כך שאותו חלק של המוח יהיה חשוף לפקדים חיוביים ושליליים. עבור anti-mGlutR1 ו פפטיד מצועם, מודנת את העבודה דילול של נוגדנים anti-mGlutR1 ב RT עם הפפטיד KLH מצומדת המכיל את הפפטיד 10-4 M (תנאי 1) וללא כל המשלים (תנאי 2). צנטריפוגה כל תערובת עבור 10 דקות ב 10,000 x g ולאסוף את supernatant משני הפקדים. מודלת את הסעיפים הסידוריים של המוח דבורת דבש עם supernatant משני התנאים והתהליך עם נוגדנים משני (שלבים 3.14-3.15). הטמע מקטעים משני התנאים בשקופית באמצעות הטבעת מדיה (שלב 3.17). 4. בדיקת RDL ו mGlutR1 חלבון ביטוי על ידי אימונולוצינטוכימיה (סעיף 3) ב דבורת המוח לאחר ההזרקה של מערכת CRISPR המקביל-Cas9 עיצוב המדריכים באמצעות כלי עיצוב מקוון CRISPR-Cas921 באמצעות רצפי DNA גנומית של AmRdl (XM_006565102 .3) ורצפים של mGlutR1 (XM_006566244 .3) (טבלה 1). סדר כ Cas9 crRNA ו Cas-9 tracrRNA עם צבע פלורסנט ATTO550 בסוף 5 ‘. סדר את Cas9 נוקיחכירה V3 (ראה טבלת חומרים). הכן את הרכיבים עבור מערכת CRISPR-Cas 9 על ידי ביצוע מלאי של 100 μM של כל מדריך crRNA ו tracrRNA באמצעות מים חינם nuclease. מחלקים ומאחסנים ב-20 ° c. להכין את ריכוז העבודה של הפתרון Cas-9 על ידי הוספת 2.5 μl של cas 9 נוקלאז V3 (10 מ”ג/mL) כדי 47.5 μl של מאגר חינם של נוקלאוטיד כדי לקבל ריכוז סופי של 0.5 μg/μl. להפוך grna ו-rnp עבור הזרקה. הכנת gRNA מורכבות היווצרות עבור כל מדריך RNA בנפרד (guideRNA: tracrRNAATTO550) תווית שפופרת בדיקה עם השם של gRNA, להוסיף 92 μL של מאגר חינם נוקלאוטיד, 4 μL של 100 μM CRISPR-Cas9 tracrRNA-5 ‘ ATTO550, ו-4 μL של מדריך crRNA פתרון. מערבבים בעדינות ומסתובבים.הערה: דוגמה של תיוג של צינורות gRNA עבור RDL: GRDL1, GRDL2, GRDL3 (המתאים RDL מדריכים ה-RNA בטבלה 1). דוגמה לתיוג של צינורות gRNA עבור mGlutR1: GMGL1, GMGL2, GMGL3 (טבלה 1). מחממים את הפתרון 95 ° c עבור 5 דקות כדי ליצור gRNA. לצנן את התערובת ב RT עבור 10 דקות. הכנת RNP מורכבות היווצרות (gRNA: S. p Cas9Nuclease), תערובות משלוח, ושליטה. סמן צינור בדיקה עם השם של RNP, להוסיף 6 μL של פתרון gRNA ו 6 μL של 0.5 μg/μL S. p Cas9 Nuclease V3. מערבבים בעדינות את הפתרונות ב 37 ° c עבור 10 דקות לפני ההזרקה.הערה: דוגמה לתוויות שפופרת RNP: RRDL1, RRDL2, RRDL3. לעשות מיקס. כדי להכין את התערובת הסופית המשמש זריקות, להוסיף 4 μL של כל RNP מ RNP יחד. RNP/RNP mix = 4 μL RRDL1 + 4 μL RRDL + 4 μL RRDL3. . לRNPmGlutR1mix מערבבים 4 μL של כל RNP מ mGlutR1 יחד כדי להכין את התערובת הסופית המשמש זריקות (RNPmGlutR1mix) = 4 μL RMG1 + 4 μL RMG2 + 4 μL RMG3.הערה: דוגמה לתוויות שפופרת RNP: RMG1, RMG2, RMG3. להפוך את השליטה noguideRNA פתרון על ידי ערבוב 4 μL של tracrRNA, 92 μL של מאגר, ו 4 μL של מים במקום guideRNA (ראה סעיף 4.3). מערבבים 6 μL של הפתרון noguideRNA זה 6 μL של 0.5 μg/μL Cas9 Nuclease V3 (שלב 4.4.1) כדי לייצר את פתרון הזרקת הבקרה. 5. נוהל הזרקה לשתק כל דבורה כמתואר בשלב 1.3 ולהאכיל אותם כמו בשלב 1.4. לאחר מכן, הכן שתי קבוצות של שתי תיבות עץ כדי לשחרר את הדבורים לאחר ההזרקה: תיבה לבנה (מצב ניסיוני) ותיבה שחורה (שליטה). כל תיבה צריכה להכיל מסרק קטן וצלחת פטרי מזינה. צד אחד של כל תיבה עשוי זכוכית כדי לאפשר התבוננות. הפוך מנות פטרי. קח את העטיפה של 35 mm צלחת פטרי, המקום שעווה בתוך המשטח, ומניחים את החלק התחתון של צלחת פטרי על השעווה. . אבטחו את הצלחת לתוך הקופסה באמצעות מזרק 5 מ ל, להזריק 1 מ ‘ הפתרון סוכרוז בין העטיפה לחלק התחתון של המנה. הדבורים יכולים במהירות לשים את החדק שלהם בין שתי הצלחות יישארו יבשים לתקופת דגירה 48 h. . שים מנה אחת בכל קופסא כדי להכין את מערכת המיקרו-הזרקה, מלא את נימי המים בשמן מינרלי ללא כל בועות אוויר. מניחים את נימים במחזיק מזרק של מערכת מיקרוהזרקה. כדי לטעון את הקפילר עם פתרון ההזרקה הרצוי, הציבו סרט הידרופובי על משטח שטוח, ופיפטה את התמיסה עליו. הכנס את השמן מהנימים והחלף את התערובת בתמהיל ה-RNP המתאים. באמצעות מערכת מיקרוהזרקה, הכנס 345 nL של פתרון התערובת RNP ישירות לתוך ocelli החציוני של כל דבורה. עבור RDL-CRISPR-Cas9 הזרקת, להזריק שמונה דבורים עם RNPRDLmix מוכן כמתואר בשלב 4.4.2. . האכילו אותם בסוכות אחרי הזריקה שחררו אותם בקופסא הלבנה (ניסיונית) עם המסרק הקטן והאכלה צלחת פטרי עבור 48 h. השתמש בעוד שמונה דבורים כפקדים ללא כל זריקות, להאכיל אותם, ולשחרר אותם בתיבה שחור (שליטה). עבור mGlutR1 CRISPR-Cas9, להזריק תשע דבורים עם RNPmGlutR1mix מוכן כמתואר בשלב 4.4.3. עבור שליטה להזריק שמונה דבורים עם תערובת RNA ללא מדריך (RNAmix_noguide) הכין כמתואר בשלב 4.4.4. . האכילו אותם בסוכות אחרי הזריקה שחררו דבורים ממחזיקי הקופסא הלבנה (מצב ניסיוני) או את הקופסה השחורה (שליטה) שהוכנה כמתואר בסעיף 5.1. מניחים את הקופסאות במיכל פוליסטירן עם נייר רטוב בפנים ללחות. השאר דבורים 48 h ולהתבונן 2x ליום כדי לוודא שיש להם מספיק אוכל ולחות טובה. מנתח את המוח של כל דבורה לאחר 48 h (שלב 3.1) והתהליך עבור האימונוציטוכימיה כמתואר בסעיף 3. עבור anti-mGlutR1 inings השימוש בשלב 3.11 ו-anti-RDL חיסוני השימוש צעד 3.12. לבצע הדמיה קונפוקלית וקד כדי להעריך את רמת הזריחה בסעיפים המערכת החיסונית מוכתם. כדי להעריך את הפחתת החלבון במוחות אימונויניום, השתמש באוסף תמונות קונפוקלית וקד באותה רמה של רווח עבור שליטה ומוזרק המוח. 6. qPCR מבוססי ירידה-off שיטת להעריך את גנומית שונה RDL DNA 48 H לאחר CRISPR Cas9 Rnprdpmix הזרקה עיצוב התחל, בקרת בדיקה, ובדיקה ירידה-off כדי להעריך את כמות ה-DNA שונה על ידי הזרקת CRISPR-Cas9. כל פריימר מתוכנן כך שהוא מאגפים לפחות אחד crispr-Cas 9 מדריך ו אמפליקון גודל הוא 132 bp. התחל והבדיקות המשמשות להלן:RDL1_For: הוראות החלקהRDL1_Rev: CAACGAGGCGAACACCATRDL1_control_probe:/5HEX/CGA + C + G + TTT + A + C + CT/שלישי/RDL1_Drop-off_probe:/56-FAM/CCTA + C + G + T + CA + A + GT/3IABkFQ/ ודא שצבעי היסוד תואמים לרצפים ייחודיים הספציפיים לאזור. ודא שה “בדיקת המסירה מיועדת לאזור החופף עם מדריך RDL-CRISPR-Cas9. כדי לבדוק אם יש שינוי של gDNA באזור המדריך, להזריק 12 דבורים ב ocelli עם התמהיל RNP_RDL המתואר בשלב 5.3.1 ולהשתמש שמונה הדבורים uninjected כמו פקדים. לנתח את המוח הדבורים ללא האונות האופטית 48 h לאחר הזריקות לחלץ את gDNA של כל המוח דבורה מוזרק ושליטה (ללא אונות אופטית) באמצעות הערכה בעקבות פרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים). להעריך את הכמות, איכות, וטוהר של gDNA שחולצו באמצעות ספקטרוסקופיה. לכמת את הביטוי היחסי של gDNA שונה של AmRDL באמצעות פרוטוקול המסירה qPCR מבוססי ו-PCR בזמן אמת הציקלer. להשהות את האוליגוס כדי 100 μM, לדלל את התחל 10 μM, ואת הבדיקות כדי 5 μM. הגדר את תגובת ה-PCR בצלחת הבאר 96 כמוצג כאן לדוגמה אחת של gdna (3 חוזר): 10 μl של מיקס מאסטר (ראה טבלת חומרים), 1 μl של התחל הקדמי, 1 μl של היפוך לאחור, 1 μl של בקרת הבדיקה, 1 μl של בדיקה של ירידה, 2 μl של gdna (50 ng), 4 μl של nuclease-מים ללא תשלום כדי להביא את נפח התגובה ההערה: הפקדים הם הפתרון במקום הדגימות והמים במקום הגששים. הגדר את תוכנית האופניים כדלקמן בזמן אמת הציקלאה PCR: 95 ° צ’ עבור 3 דקות ואחריו 40 מחזורים של 95 ° צ’ עבור 15 s, 60 ° c עבור 1 דקות. הערכת השינוי הגנטי היחסי באמצעות השיטה 2-ΔΔCt , כאשרו 7. כימות יחסי של RDL RNA 48 H לאחר הזרקה RNPRDLmix כדי לבדוק אם יש הפחתה של RDL mRNA, להזריק 20 דבורים ocelli עם RNP_RDL mix כמתואר בשלב 5.3.1 ולהשתמש 12 דבורים uninjected כמו הפקדים. לנתח את המוח דבורים (ללא אונות אופטיות) 48 h לאחר הזריקות, לחלץ את mRNA הכולל מכל דבורה מוזרק, ונפרד באמצעות פרוטוקול של היצרן (ראה טבלת חומרים). הסר שאריות דנ א שנותרו במדגם באמצעות ערכת DNA-free (ראה טבלת חומרים). הערכת האיכות והטוהר של ה-RNA המחולצים באמצעות ספקטרוסקופיה. לכמת את הביטוי של Amrdl באמצעות מסחרית זמין הפלורסנט ירוק RT-PCR Kit (טבלה של חומרים) על בזמן אמת ציקלאר pcr באמצעות פרוטוקול של היצרן עבור 384 צלחת היטב.הערה: בניסוי זה נעשה שימוש בתחל שפורסם בעבר. עבור Amrdl (AMRDL_F GGTCGCTACCTG; AmRDL_R TCGATCGACTTGACGTAGGA)22 ו-אקטין התחל בתור גן התייחסות [AmActin_F TGCCAACACTGTCCTTTCTG; AmActin_R GAATTGACCCACCAATCCA]23. ביטוי הגנים היחסי חושב באמצעות השיטה 2-ΔΔCt (שלב 6.6). 8. qPCR מבוסס-off שיטת הערכה כדי להעריך את ה-DNA גנומית שונה 48 H לאחר הזרקת RNPmGlutR1mix לעצב את התחל, שליטה, ולשחרר את הבדיקות כדי להעריך את כמות ה-DNA שונה על ידי הזרקת CRISPR-Cas9. עיצוב התחל כך שהם מאגפים לפחות אחד crispr-Cas 9 מדריך וגודל אמפליקון הוא 96 bp.mGlutR1_For: המנון בלבדAmGlurR1_Rev: GGAGAGAGGGAGCGAGAAAmGlurR1_control_probe:/5HEX/CGAGG + G + AAA + CGA + GT/שלושהAmGlurR1_Drop-off_probe:/56-FAM/CGA + C + A + C + CG + TC/3IABkFQ/הערה: ודא שהצבעי התחל תואמים לרצפים ייחודיים הספציפיים לאזור שהיו אמורים להיות שונו. החללית הנפתחת מיועדת לאזור שחופף למדריך CRISPR-Cas9. כדי לבדוק אם יש שינוי של gDNA באזור המדריך, להזריק 12 דבורים ocelli עם RNP_ GlutR1 לערבב כמתואר בשלב 5.3.1 ולהשתמש שמונה הדבורים uninjected כמו פקדים. לנתח את המוח דבורים (ללא אונות אופטיות) 48 h לאחר הזריקות ולחלץ את gDNA מכל מוח דבורה הזריק ושליטה (ללא אונות אופטית) באמצעות פרוטוקול של היצרן (ראה טבלת חומרים). להעריך את הכמות, איכות, וטוהר של gDNA שחולצו באמצעות ספקטרוסקופיה. לכמת את השינוי היחסי של gDNA AmGlutR1 באמצעות פרוטוקול הירידה qPCR ו-PCR בזמן אמת כמתואר בשלב 6.5. הערכת השינוי הגנטי היחסי באמצעות השיטה 2-ΔΔCt , כאשרו 9. קוונפיקציה של mGlutR1 RNA 48 h לאחר הזרקת RNPmGlutR1mix כדי לבדוק אם יש ירידה mGlutR1 RNA mRNA, להזריק שש דבורים ocelli עם מיקס RNP_RDL כמתואר בשלב 5.3.2 ולהשתמש שש דבורים uninjected כמו פקדים. לנתח את המוח דבורים (ללא אונות אופטיות) 48 h לאחר הזריקות, לחלץ את mRNA הכולל מכל דבורה מוזרק, ונפרד באמצעות פרוטוקול של היצרן עבור בידוד RNA (ראה טבלת חומרים). הסר שאריות דנ א שנותרו במדגם באמצעות ערכת DNA-free (ראה טבלת חומרים). הערכת האיכות והטוהר של ה-RNA המחולצים באמצעות ספקטרוסקופיה. לכמת את הביטוי של mGlutR1 באמצעות ערכת ה-Pcr הירוק של sybr (ראה טבלת חומרים) על בזמן אמת הציקלאה של ה-pcr עם הפרוטוקול המסופק על ערכת היטב 384. השתמש בצבעי היסוד הבאים לmGlutR1 (mGlut_F cctcctcactggggggggggacttca; mGlut_R TGCCGTTGTGTTCCGATTT) ו אקטין התחל כמו גן התייחסות [AmActin_F TGCCAACACTGTCCTTTCTG; AmActin_R GAATTGACCCACCAATCCA]. חשב את ביטוי הגנים היחסי באמצעות שיטת 2-ΔΔCt (שלב 8.6).
Representative Results
בדיקות נוגדן נגד RDLהנוגדנים הופקונגד מעלהפפטיד rdl כפי שמוצג באיור 1. הצעד הראשון באפיון נוגדנים נגד RDL היא לבדוק את ההגון של החלבון שחולצו מן המוח דבורה באמצעות כתם מערבי עם נוגדנים anti-RDL ו עז מתויג האנטי-ארנבת הג השני נוגדן (איור 1a, הוספה). שני נוגדנים anti-RDL הכירו את הלהקה ממוקם ב ~ 50-60 kD (חץ), המתאים את המשקל המשוער של מערכת המשנה RDL של חלבונים. כדי להדגים שנוגדנים נגד RDL הכירו את הפפטיד בפרוסות המוח, השתמשנו בבקרת מקדימות (איור 1ב, ג). כאשר הנוגדנים היו טרום מודקות עם פפטידים מצובטים, ההכתמים על החלק היה נעדר. זה הוכיח כי נוגדנים נגד RDL הכירו את הפפטיד מצומדת נגדם הם גדלו. על מנת להדגים את הנוגדנים נגד RDL לזהות את החלבון ברקמת המוח קבוע, השתמשנו CRISPR-Cas9 כדי להפיל את הגן RDL שמייצר את חלבון RDL בתאים. איור 1D1-3, מראה השליטה הקדמית במוח סעיפים שסומנו עם נוגדנים anti-rdl. הדבורה לא הוזרק עם RDL-CRISPR-Cas9 RDL. באיור 1D1, מדבקות נגד rdl מעצבים בחלק הקדמי של המוח דבורים. החלק הפרונטלי באיור 1D2 מראה את היעדר הזריחה מATTO550, מכיוון שמכלול RDL-Crispr-Cas9 לא הוזרק. איור 1E1-E3 מראה קטע המוח מתוך דבורה הזריק עם RDL-Crispr-Cas 9 ולאחר מכן מעובד עם אותה כמות של נוגדנים כמו המוח בקרת באיור 1D1-D3. כתמים נגד RDL הופחת באופן משמעותי במוח כולו 48 h לאחר ההזרקה, ואת התפלגות ATTO550 כתמים במוח (איור 1E2) מראה את ההצלחה של RDL-Crispr-Cas 9 זריקות החציון הדבורה ocelli. מספר התאים הפזורים. בתצוגת המוח ATTO550 הזריקה המוצלחת של RDL-CRISPR-Cas 9 צמצמה את ביטוי החלבון בהשוואה לפקד (איור 1E1-3). מתוך שמונה מוחות חיסוני ויטראז ‘, רק מוח אחד היה רמה גבוהה של הפצה של RDL-CRISPR-Cas9 בתאי הגוף פטריות, פרוטומוח, ו האונה האנטנה, בעוד מוחות אחרים היה תא מכתים עם ATTO550 calyx הגוף פטריות, קומפלקס מרכזי, אבל לא האונה האנטנה. חשוב לציין כי בדבורים אלה, הפחתת כתמים אנטי RDL לא היה דרמטי כמו במוח המוצג באיור 1E1. הבא, כדי להעריך את הרמה של RDL ששונתה gDNA בדבורים 48 h לאחר RDL-CRISPR-Cas9 הזרקת, ביצעת מבחן הירידה qPCR, שבו החללית המסירה תוכננה להתאים את האזור של אחד RDL gRNAs. בניסויים אלה, במוח הדבורים שהוחדרו עם RDL-CRISPR-Cas 9, הפחתה יחסית של הזריחה התכתב עם מספר gDNA שונה בדגימות. במבחנים שלנו את האזור המתאים מדריך זה ב gDNA ב 12 דבורים הוזרק עם RDL-CRISPR-Cas9 היו 64% ± (ממוצע ± 30% SD) לעומת gDNA בדבורים לא מוזרק (איור 3א). הבא, כדי להעריך את הרמה של ה-RNA RDL בדבורים 48 h לאחר ההזרקה, ביצעו רביעיית-PCR בקבוצה נפרדת של דבורים (איור 3ב). השוונו את רמת ה-RNA RDL של RDL-CRISPR-Cas 9 דבורים מוזרק (n = 19) עם רמת RNA בדבורים שלא הוזרק (n = 12). בניסויים אלה, הפחתת היחסי של mRNA RDL היה 59% ± (ממוצע ± 15% SE) בהשוואה לרמה של RNA בדבורים שאינן מוזרקים. כאשר בדקנו את רמת ה-RNA RDL בכל הדבורים בנפרד, רק 13 דבורים מתוך 19 דבורים הראו ירידה משמעותית של RNA. נתונים אלה מצביעים על כך הזרקה של RDL-CRISPR-Cas9 דרך ocelli אולי לא תמיד להגיע מספר גדול של תאי המוח, אשר מאשרת את הנתונים עם RDL מוכתם החיסונית RDL-CRISPR-Cas9 מוזרק דבורים. בהכנות אלה, רק דבורה אחת מתוך 8 היה rdl פריך-Cas9 בתאי מוח רבים (גוף פטריות, פרוטומוח, והאונה הקודקודית) לעומת מוחות דבורים אחרים, שם התפלגות rdl-crispr-Cas9 היה מרוכז בתאים של פרוטומוח (גביע הגוף פטריות ומתחם מרכזי) אבל לא את האונה האנטנה (איור 4א-ד). מבחני נוגדנים נגד mGlutR1השתמשנו הנוגדנים anti-mGlutR1 המיוצר ארנב נגד פפטידים מצופנים ספציפיים לדרוסופילה melanogaster (איור 2א). הרצף של פפטיד זה מראה 94% זהות עם פפטיד דבורים (CLSDKTRFDYfartvppd) איור 2א. קודם כל, בדקנו את הנוגדנים נגד. חלבון מוח הדבורים באמצעות החיסונית המוח דבורה המגון אכל היה מופרד על ידי 10% SDS-עמוד ו אלקטרופיניסטי הועבר מקרום ניטרוצלולוזה ומוכתם עם anti-mGlutR1. ההוספה באיור 2A מציגה שתי להקות עם משקולות מוערך (103 ו 83 kD) מתאים לשני איזוטפסים. כאשר בדקנו את הנוגדן על המוח דבורת דבש, מצאנו כי הם לתייג פרופילים נוירופילאר ותאים בסעיפים המוח דבורה כמודגם באיור 2B, D. לאחר מראש של הנוגדן anti-mGlutR1 עם פפטיד-mGlutR1 מצוורתיים, הצביעת המסוים נעלם בפרוסת המוח דבורה (איור 2ג). זה מאשר שנוגדנים נגד mGlutR1 מזהים את הפפטיד (איור 2ג). הבא, הזרקנו שילוב של mGlutR1-CRISPR-Cas9 ב החציון ocelli והשתמש noguideRNA הבקרה. בדבורים השליטה (n = 7), הקרינה הפלואורסצנטית מ-ATTO550 לא התמקדה בתאים. מוחות מסוימים היו מפוזרים ATTO550 תיוג הקרינה. כך, הכנת שליטה באיור 2D1-3 מראה anti-mGlutR1 כתמים במוח, אבל לא את הזריחה ATTO550. כאשר mGlutR1-CRISPR-Cas9 הוזרק לתוך ocelli ונלקח על ידי תאים רבים, רמת הזריחה של הנוגדנים המשניים הופחת באופן משמעותי באזור זה uptakes וקח את mGlutR1RNP פונקציונלי (איור 2E1-3). הדבורים היו מנוטרים עבור 48 h, ודבורה אחת מכל מצב ניסיוני נמצא מת. כך, בניסוי זה, בדקנו שבע דבורים שליטה ושמונה CRISPR-Cas9 דבורים. כל הדבורים הזריקו עם CRISPR-Cas9 היו תאים שנטלו ב mGlutR1-CRISPR-Cas9. רוב התאים הללו היו calyx של הגוף פטריות, מתחם מרכזי, ו האחורי פרוטוברוק. רק שתי הדבורים מתוך 7 הראה ATTO550 תיוג בתאים רבים בגוף פטריות, במתחם המרכזי, ואת האונה האנטנה. דוגמה לאחת מהדבורים הללו מוצגת באיור 2E. הפחתת רמת הmGlutR1 בהכנות הללו הייתה משמעותית. את חמשת הדבורים האחרות יש ATTO550 תיוג המתאים למסירה מוצלחת של mGlutR1 CRISPR-Cas9 בגוף פטריות האחורי המוח אבל לא באונות אנטנה. הבא, כדי להעריך את הרמה של mGlutR1 gDNA שונה בדבורים 48 h לאחר ההזרקה, ביצעו מבחן המסירה qPCR מבוסס, שבו החללית המסירה תוכננה להיות באזור ליד מדריך mGlutR1. בניסויים אלה, במוח דבורה הוזרק עם mGlutR1-CRISPR-Cas 9, השינוי היחסי של gDNA ב 12 דבורים היו 59% ± (ממוצע ± 33% SD) לעומת gDNA ב דבורים לא מוזרק (איור 3א). תוצאות אלה אושרו גם על ידי בדיקות רביעיית ה-PCR בקבוצה שונה של דבורים, שם הערכנו את רמות mGlutR1 RNA באמצעות רביעיית PCR בדבורים 48 h לאחר זריקות עם RNPmGlutR1mix (איור 3ב). השוונו את רמת mGlutR1 RNA של mGlutR1-CRISPR-Cas9 דבורים מוזרק (n = 6) עם רמות RNA דבורים שלא הוזרק (n = 6). בניסויים אלה, הפחתה יחסית של mRNA mGlutR1 בדבורים מוזרק היה 53% ± (ממוצע ± 18% SE) לעומת דבורים לא מוזרק (איור 3ב). הסעיף מתוך ארבע דבורים שונות הביעו RNP RNP-CRISPR-Cas9 בתא הקניון של הגוף פטריות מוצג באיור 4A-D. הדבורה לדוגמה עם ATTO550 פלואורסצנטית בגוף הפטריה והאונה הקודקודית מוצג באיור 4E, F. דריכים רצפים gRNA היחידה ל, RNP [הגודרנה] [gRNA: Cas9 Nuclease] RDL_Guide1 ACCGTAACGCGACCCCCGCT GRDL1 RRDL1 RDL_Guide2 AACGTCGATCGACTTGACGT GRDL2 RRDL2 RDL_Guide3 CCATGACGAAACACGTGCCC GRDL3 RRDL3 mGlu_Guide 1 ליאת שגיא GMGL1 RMGL1 mGlu_Guide 2 כוהל החתול GMGL2 RMGL2 mGlu_Guide 3 GCAAACGTCGGTAGGAGTGA GMGL3 RMGL3 טבלה 1: הנוקלאוטיד רצפים של מדריכים המיועדים Rdl ו mGlutR1. איור 1: אפיון נוגדנים נגד RDL. (א) סכמטי של יחידת המשנה RDL, שם העיגולים הוורודים מצביעים על הלוקליזציה של פפטיד 2 (מסחטותCVNEKQSYFHIATTFIRI-amide) ב N-הטרמינוס ו פפטיד 1 (התאיים CVRFKVHDGGTL-amide) ב C-טרמינוס. הכנס A מציג את הלהקות בכתם המערבי של תמציות המוח דבורת דבש מעובד עם נוגדנים נגד RDL המקביל (אחד עם anti-RDL pep1 ו-anti-rdl pep2). כל כתמי חיסוני מראה את הגודל לכאורה של החלבון ~ 50-60 kD, המתאים משקולות מוערך של isoform שונים של יחידות המשנה RDL. (ב, ג) ספיחה של נוגדנים נגד RDL עם פפטיד מצומדת 1. התמונה ב- C מראה ירידה בצביעת המקטע כאשר הנוגדנים היו מודתמים באמצעות פפטיד 1. הגוף בצורת מאוורר (פנסיון מלא) והגוף אליפסואיד (eb) הם מבנים מורכבים מרכזיים במוח. M = האונה המדיאלי של גוף הפטריה. (D1-3) Anti-RDL כתמים של פקד, המוח לא מוזרק בתחום הדבורים אחרי 48 h. Green מציין את הפרופיל החיובי נגד RDL במוח. (D2) דבורה זו לא הוזרק ואינה מכילה ATTO550 פלואורסצנטית. (שוהם) תמונות ממוזגות מ- D1 ו- D3. (E1-3) ההזרקה של RDL-CRISPR-Cas9 מופחת נגד RDL צביעת לאחר 48 h. (E2) ATTO550 הזריחה בגרעין התא הצביע מוצלחת RDL-Crispr-Cas9 משלוח. ((E3) התמונה הממוזגת של anti-RDL (ירוק) ו-ATTO550 (אדום). סרגל בקנה מידה = 100 יקרומטר (B-E). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: אפיון נוגדנים נגד mGlutR1. (A) סכימטי של GCPR חייאה mGluR זה מראה את מלטזופילה מלאנוגסטר פפטיד המשמש חיסון. לצורך השוואה, פפטיד המנה הישנה של ממשקי api מוצגת להלן. המעגל מציין את הלוקליזציה של פפטיד ב-N-טרמינוס של התחום לmGlutR1 קולטן. הכנס in A מראה כי נוגדנים Anti-mGlutR1 הכירו שתי להקות באבן החשופה המערבית של מוחות דבורה ~ 103 kd ו ~ 83 ק. ק. המתאימים למשקולות המשוער של איזוטפסים ידועים. (ב, ג) שליטה מראש של הנוגדן anti-mGlutR1 בשני קטעים רצופים של פקולי האונה אנטנה. התמונה של anti-mGlutR1 בסעיף לפקולי האנטנה ב C מראה את הפחתת ההכתמים כתוצאה של טרום דגירה של פפטיד Anti-mGlutR1 עם נוגדן אנטי mGlutR1. הליך זה גורם לנוגדן לזרז את הפתרון, אשר מבטל את הצביעת בהשוואה ל- B (בקרה, העדר פפטיד ב טרום הדגירה). (D1) מראה כתמים של Anti-mGlutR1 בפרוסת מוח דבורה לאחר הזרקת שליטה ב ocellus חציון. הזרקה זו חסרה mGlutR1 gRNA המאפשר להפיל את קולטני mGlutR1 על ידי CRISPR-Cas9, ולכן הצביעת של הנוגדן נגד mGlutR1 לא הופחת (ירוק). (D2) העדר ATTO550 פלואורסצנטית מצביע על העדר CRISPR פונקציונלי-Cas9 במוח. (שוהם) תמונות ממוזגות של anti-mGlutR1 ו-ATTO550. (E1-E3) להראות את הצביעת של Anti-mGlutR1 בחלק המוח שבו mGlutR1 כבר הופל לצמיתות 48 h לאחר ההזרקה עם mGlutR1-CRISPR-Cas 9 ב חציון ocellus. כך, ההכתמים במוח הזה מופחת מאוד בשל נוקאאוט מוצלח של mGlutR1 בתאים רבים. (היכל ה,E2) ATTO550 מכתים בגרעין תאים רבים במוח הדבורים מציין כי הזרקה של mGlut1-CRISPR-Cas 9 היה מוצלח. ((E3) התמונה הממוזגת של ATTO550 (אדום) ואנטי-mGlutR1 (ירוק). סרגל בקנה מידה = 10 יקרומטר (B, C); 100 יקרומטר (D, E). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: הערכה של gDNA שונה וביטוי של mRNA של Rdl ו mGlutR1 mrna במוח דבורה 48 h לאחר ההזרקה עם 345 NL של המקביל RDL Crispr-Cas9. (א) מבחן השינוי המבוסס על qpcr כדי להעריך את כמות ה-gdna עם אזור שינוי שחושבו באמצעות 2-ΔΔCt שיטה ומנורמל נגד שליטה, המוח לא מוזרק. הנתונים מבוטא כממוצע + SD. (ב) מבחן הרביעיית-PCR שימש כדי להעריך את כמות mrna ב CRISPR-Cas9 מוזרק ומוזרק דבורים. AmActin שימש גן התייחסות. ביטוי הגנים היחסי מחושב באמצעות שיטות 2-ΔΔCt ומנורמל כנגד שליטה, המוח שאינו מוזרק. הנתונים מבוטאים כממוצע + SE. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: דוגמה להפצת RNP CRISPR-Cas9 במוח דבורים באמצעות ATTO550 פלואורסצנטית. (A-D) המוח סעיפים מתוך ארבע דבורים שונות הביע RNP RNP-CRISPR-Cas9 בתוך תא קניון של הגוף פטריות. (E, F) דוגמה לשני מוחות 48 h לאחר ההזרקה עם RNPmGlutR1 CRISPR-Cas9. סרגל בקנה מידה = 150 יקרומטר (A-F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
אפיון האנטי-RDL ואנטי-mGlutR1
ראשית, אנו לאפיין את anti-RDL ו anti-mGlutR1 נוגדנים על ידי כתמי חיסוני ו טרום adsorption על הפרוסות של המוח הונאיבי קבוע. כל נוגדן נעשה כדי לזהות את כל האיזוטפסים הידועים שלה, והניתוח המערבי מראים שהם מכירים להקות המתאימות למשקולות המולקולריות שלהם. לאחר מכן, שני הנוגדנים נחסמו על ידי הפפטיד שבהם הם יוצרו על מקטעים המוח דבורת דבש.
אחת המטרות הראשונות במחקר שלנו היתה לקבוע כי הנוגדנים המיוצרים נגד פפטיד מעלה מעלה ספציפית הם ספציפיים חלבון שלה רקמת מוח קבוע. למטרה זו, ניצלנו את מערכת CRISPR-Cas9. עיצבנו מדריכים ספציפיים עבור דבורת דבש Rdl ו mGlutR1 והשתמשו בכל אחד מהם כדי להפוך Crispr-Cas9 עם תווית בדיקה פלורסנט ATTO550. עבור כל קולטן, הזרקנו תערובת של שלושה שונים CRISPR-Cas9 ribonu, באוקלי כדי להפחית את כמות החלבון הייעודי במוח דבורת דבש למבוגרים על ידי ביטול הגן המתאים בתאים שנטלו את שלנו מערכת Cas9 מעוצבת. בחדר העבודה שלנו הצלחנו לבצע את הצעד הזה.
אחד הצעדים הקריטיים הראשונים להצלחת ניסויים אלה הוא עיצוב המדריך המתאים RNAs. אנו ממליצים לעצב עד חמישה מדריך RNAs, הממוקם בתחילת, באמצע, ואת סוף רצף הגנים. בעבודתנו הראשונית בדקנו אותם בצירופים שונים בשלוש עד חמש דבורים. ניסינו גם ריכוזים שונים של זריקות, כמו גם פעמים לאחר ההזרקה, ותערובות שונות של RNP בזריקות. הצלחנו לגזור את המוח ולעבד אותם באמצעות נוגדנים anti-RDL ו anti-mGlutR1. במבחנים ראשוניים אלה, הקמנו את השילוב המתאים, זמן לאחר ההזרקה, כמו גם את הריכוז ואת כמות CRISPR-Cas9 להזרקה. בדיקות ראשוניות אלה היו הבסיס להקמת הניסויים שתיארנו בפרוטרוט כאן.
המטרה היתה two-קיפול: 1) כדי להדגים דבורה כי כתמים הנוגדן שלנו הופחת לאחר הטיפול עם CRISPR-Cas9 ו 2) לעבוד באמצעות התנאים הניסיוניים הטוב ביותר למחקרים התנהגותיים. כך, אנו מראים כי אם הרבה גרעיני התא מכילים CRISPR-Cas9 48 h לאחר ההזרקה, הפחתת anti-RDL ו anti-mGlutR1 כתמים הוא משמעותי. בנוסף, זה מדגים את הנוגדנים נבדק במפורש לזהות את mGlut1 ו RDL חלבון בהכנה המוח דבורת דבש וכי הם יכולים לשמש ללימודי לוקליזציה במוח דבורת דבש.
הגדרה ניסויית של CRISPR-Cas9 למחקר התנהגותי
בשלב הבא, אנחנו מוכנים לערוך את הניסויים כך שניתן יהיה להשתמש ב-CRISPR-Cas9 במחקרים התנהגותיים. שמונה או תשע דבורי דבש נאספו עבור שליטה וטיפולים ניסיוניים. הם נבדקו לפני ואחרי הזרקה, ולאחר מכן המוחות שלהם עובדו עבור ATTO550 ו/או החיסונית כדי לקבוע את אזורי המוח הראו ירידה של חלבון היעד. כאן חיוני לציין כי מספר הדבורים שצולמו עבור סט אחד של ניסויים היה מוגבל לא יותר מ 8-9 דבורים עבור השליטה והניסויים הניסיוניים. בדרך זו ניתן לבדוק את שני התנאים באותו יום. כמו כן, ברגע שהכנו את תערובות CRISPR-Cas9 להזרקה, מעולם לא הקפאתי אותם. התערובת CRISPR-Cas9 לא שינוי בעוצמה כאשר השתמשו 3 ימים ברציפות ושמרו ב 4-8 ° c. עם זאת, לא בודקים את זה אחרי שלושה ימים.
כפי שתיארנו בסעיף תוצאות עבור שתי קבוצות של זריקות ניסיוני עבור שני נוגדנים, רק שלוש דבורים מתוך 16 נבדק הראו הפצה גדולה ATTO550 בגוף פטריות, פרוטומוח, ו האונות האנטנה. בכל הדבורים האחרות, התפלגות CRISPR-Cas9 הייתה מוגבלת לגוף הפטרייה, לקומפלקס המרכזי, ו/או האחורי של המוח. חיוני להבין לכל מחקרים התנהגותיים כי באמצעות שיטת הזרקה זו הפחתת חלבון היעד יהיה מוגבל רק לגוף פטריות ברוב הדבורים. זה לא להאריך את האונה האנטנה או subesophageal גנגליון. כך, טכניקת ההזרקה שבה אנו משתמשים מתאים ללמוד את ההשפעה של הפחתת קולטנים בגוף הפטרייה ובמתחם המרכזי בניסויים התנהגותיים, בעוד שיטה שונה של החדרת CRISPR-Cas9 יהיה מתאים יותר לחקר אזורי מוח אחרים.
לסיכום, המחקר שלנו הפגינו יישום מוצלח של CRISPR-Cas9 כפקד עבור כתמים נוגדן במוח. עבור שני הנוגדנים (anti-RDL ו anti-mGlutR1), כאשר ספיגה של mGlutR1-CRISPR-Cas9 או RDL-CRISPR-Cas9 היה מוצלח, רמת מכתים נוגדנים המקביל היה גם מופחת באופן משמעותי. כמו כן, חיוני לציין כי הזרקה ocelli הוביל להפצה של CRISPR-Cas9 במוח זה לא היה הומוגנית. ההפצה מגוונת מאזור מינימלי המקיף את הגוף ocelli ופטריות לתאים רבים במוח כולו. השונות של mGlutR1-or RDL-CRISPR-Cas9 ספיגה על ידי התאים היה סביר בשל וריאציה בזריקות. הנתונים שלנו מראים כי מערכת CRISPR-Cas9 עובד בדבורי דבש, אבל את שיטת ההזרקה צריך להיות משופר כדי להפחית את השונות של ספיגת CRISPR-Cas9 על פני המוח דבורה בודדים. בתוך הגבלות אלה, ניתן כעת להשתמש בטכניקה זו כדי לטפל בגנים בדבורים מבוגרים לניסויים התנהגותיים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הפרסים הבאים BHS: תוכנית המדע גבולות האדם; (R01 GM113967); מעבדת רעיונות NSF (1556337). פפטיד ונוגדנים עבור DmGluRA עוצבו במעבדה ד ר. סרג ‘ בירמן (מרסיי, לומיי, צרפת) כאשר הוא נתמך על ידי תוכנית d’Urgence ודבק/Postdocs UFP20060306548 מתוך לשפוך את לה Recherche מדיקה. אנחנו אסירי תודה על דניאלה סנתורו Marosi ואלכס Hanter מ-DNA טכנולוגיה משולבת (IDT) לעזרה עם העיצוב של מדריכי RDL ו-qPCR המסירה assays.
Materials
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283_100 mL | western blotting |
| Acrylamide-bis Acrylamide | Bio-Rad | 500 mL 1610156 | western blotting |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A0169-250g | used with distilled water to fix honey bee brain in blocks |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Research Laboratories | 711-546-152 | secondary antibody to reveal the primary antibodies from rabbit |
| Alt-R CRISPR-cas9 tracrRNA-5'ATTO | IDT | 1075934 | with desinged guide RNA, it creates gRNA |
| Alt-R S.p. Cas9 nuclease V3 | IDT | 1081058 | enzyme used to make ribonucleoprotein for CRISPR system |
| Ammonium Persulfate | Bio-RAD | 10 g 1610700 | western blotting |
| Anti-mGlutR1 antibodies | Covalab (FRANCE)/21st Century Biochemical | characterized by authors in present paper | Used for primary incubation of mGlut 1 in honey bees |
| Anti-RDL antibodies | 21st Century Biochemical | characterized by authors in present paper | Used for primary incubation of RDL in honey bees |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | Y0001154 | protease inhibitor |
| Barraquer Iris Scissors 7mm Blade Sharp point | World Precision Instruments | 14128-G | used for dissection honey bee brain |
| Benzamidine | Sigma-Aldrich | 12072 | protease inhibitor |
| Blade (breakable) for blade holder | Fine Science Tool | 10050-00 | dissection for western blotting |
| Blade holder and breaker | Fine Science Tool | 15309 | dissection for western blotting |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100 F | for injection procedure |
| Chemiluminescent western blot detection substrate | Bio-Rad | 1705062 | western blotting |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 472476-50mL | RNA isolation |
| Dithiothreitol | Bio-Rad | 1610611 | western blotting |
| DNA easy kit | QIAGEN | 69504 | DNA extractionuj |
| DNA-free kit | INVITROGEN | AM1907 | Used to remove DNA |
| Eppendorf Research plus pipette, 3-pack | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
| Falcon 24 Well Polystyrene Multiwell | Falcon | 351147 | Multiwell |
| Flat Bottom Embedding Capsules, Polyethylene | Electron Microscopy Science | 70021 | basket for brain sections |
| Forceps Dumont #5 (pair) | Fine Science Tool | 11254-20 | for dissection of honey bee brain from the head |
| Forceps Dumont #5S (pair) | Fine Science Tool | 11252-00 | to clean up the brain from trachea befor dissection |
| Gene Expression Master Mix | Integrated DNA Technologies | 1055770 | qPCR drop off assay |
| Glutaraldehyde | EMS | 16220 | used for preparation of peptide conjugates for control peabsorption |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500 mL | western blotting, embedding media |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | western blotting |
| Hydrophobic filtered nylonmesh | Spectrum Labs | 145910 | for bottom of basket for brain sections |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-50mL | RNA isolation |
| Keyhole limpet hemocyanin | Sigma-Aldrich | H7017 | used for preparation of conjugates for control |
| LSM800 cofocal microscope | Zeiss | ||
| mGlu_Guide 1 | IDT | designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences | |
| mGlu_Guide 2 | IDT | designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences | |
| mGlu_Guide 3 | IDT | designed guide RNA for CRISPR. Target mGlutR1 genome sequences | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | western blotting |
| 96-well PCR microplate | Applied biosystem | 4346907 | qPCR drop off assay and qRT-PCR |
| 384-well PCR microplate | Sigma-Aldrich | Z374911 | qRT-PCR |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904_500mL | for injection procedure |
| Model p87 Flaming Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Capillary Preparation | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | for embedding solution |
| Nanoliter 2000 | World Precision Instruments Nanoliter | Injection Apparatus | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Research Laboratories | AB_2337258 | blocking agent for immunocytochemistry |
| Non-immune Goat Serum | Invitrogen | 50-062Z 100 mL | blocking agent for immunoblotting |
| Nuclease-free buffer | IDT | 1072570 | Nuclease-free buffer that is used in the preparation of CRISPR-Cas9 injection |
| Nuclease-free water | IDT | AM9337 | nuclease -free water that is used in preparation of CRISPR-Cas 9 system |
| OrbitalShaker Mp4 | Genemate | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500 g | used with PBS to make fixative for bee brains |
| Phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626-250 mg | protease inhibitor |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | Used with Paraformaldehyde as fixative; buffer for antibodies |
References
- Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current Protocols in Human Genetics. 83 (15), 7-27 (2014).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Kouranova, E., et al. CRISPRs for Optimal Targeting: Delivery of CRISPR Components as DNA, RNA, and Protein into Cultured Cells and Single-Cell Embryos. Human Gene Therapy. 27 (6), 464-475 (2016).
- Schubert, M., et al. Fluorescently labeled tracrRNA provides efficient genome editing while allowing cellular microscopy and FACS analysis. Genome Editing. , 1-3 (2017).
- Kucharski, R., Mitri, C., Grau, Y., Maleszka, R. Characterization of a metabotropic glutamate receptor in the honeybee (Apis mellifera): implications for memory formation. Invertebrate Neuroscience. 7 (2), 99-108 (2007).
- Aronstein, K., Auld, V., Ffrench-Constant, R. Distribution of two GABA receptor-like subunits in the Drosophila CNS. Invertebrate Neuroscience. 2 (2), 115-120 (1996).
- Thompson, M., Steichen, J. C., ffrench-Constant, R. H. Conservation of cyclodiene insecticide resistance-associated mutations in insects. Insect Molecular Biology. 2 (3), 149-154 (1993).
- Chung, B. Y., Kilman, V. L., Keath, J. R., Pitman, J. L., Allada, R. The GABA(A) receptor RDL acts in peptidergic PDF neurons to promote sleep in Drosophila. Current Biology. 19 (5), 386-390 (2009).
- Taylor-Wells, J., Hawkins, J., Colombo, C., Bermudez, I., Jones, A. K. Cloning and functional expression of intracellular loop variants of the honeybee (Apis mellifera) RDL GABA receptor. Neurotoxicology. 60, 207-213 (2017).
- Jones, A. K., Sattelle, D. B. The cys-loop ligand-gated ion channel superfamily of the honeybee, Apis mellifera. Invertebrate Neuroscience. 6 (3), 123-132 (2006).
- Dupuis, J. P., et al. Homomeric RDL and heteromeric RDL/LCCH3 GABA receptors in the honeybee antennal lobes: two candidates for inhibitory transmission in olfactory processing. Journal of Neurophysiology. 103 (1), 458-468 (2010).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).
- Guo, X., Wang, Y., Sinakevitch, I., Lei, H., Smith, B. H. Comparison of RNAi knockdown effect of tyramine receptor 1 induced by dsRNA and siRNA in brains of the honeybee, Apis mellifera. Journal of Insect Physiology. 111, 47-52 (2018).
- Roth, A., et al. A genetic switch for worker nutrition-mediated traits in honeybees. PLOS Biology. 17 (3), e3000171 (2019).
- Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. Production of Knockout Mutants by CRISPR/Cas9 in the European Honeybee, Apis mellifera L. Zoological Science (BIOONE). 33 (5), 505-512 (2016).
- Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. High-Efficiency CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing in Honeybee Apis mellifera Embryos. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).
- Smith, B. H., Burden, C. M. A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research. Journal of Visualized Experiments. (91), e51057 (2014).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Rodriguez, J., Deinhardt, F. Preparation of a semipermanent mounting medium for fluorescent antibody studies. Virology. 12, 316-317 (1960).
- . Custom Alt-R® CRISPR-Cas9 guide RNA Available from: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM (2019)
- Bonnafe, E., et al. Effect of a thymol application on olfactory memory and gene expression levels in the brain of the honeybee Apis mellifera. Environmental Science and Pollutant Research (International). 22 (11), 8022-8030 (2015).
- Wang, Y., et al. Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honeybee ovaries. Journal of Experimental Biology. 215 (Pt 1), 124-134 (2012).
Cite This Article
Sinakevitch, I., Kurtzman, Z., Choi, H. G., Ruiz Pardo, D. A., Dahan, R. A., Klein, N., Bugarija, B., Wendlandt, E., Smith, B. H. Anti-RDL and Anti-mGlutR1 Receptors Antibody Testing in Honeybee Brain Sections using CRISPR-Cas9. J. Vis. Exp. (155), e59993, doi:10.3791/59993 (2020).