الكشف عن 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين في الخلايا الجذعية العصبية وعقول الفئران

وقد ثبت التعديلات الجيني، بما في ذلك تعديل الحمض النووي، وتعديل الهيستون وتعديل الحمض النووي الريبي، للعب وظائف أساسية في العمليات البيولوجية المتنوعة والأمراض^{1،2،3، 4 , 5 , 6 , 7}– ولفترة طويلة، اعتُبر مثيلة الحمض النووي (أي 5-ميثيلسيتوسين (5-م.م)) علامة جينية مستقرة للغاية ولا يمكن تعديلها مرة أخرى في الجينوم. في الآونة الأخيرة، تم العثور على أن 5-mC يمكن أكسدة إلى 5-هيدروكسي ميثيلسيتوسين (5-hmC) من قبل TET (10-11 translocations) البروتينات العائلية بما في ذلك TET1، TET2، وTET3^8،9. وتظهر دراسات أخرى أن 5-hmC يمكن أن تكون بمثابة علامة مستقرة ولعب الأدوار البيولوجية من خلال تنظيم التعبير الجيني^{4،10،11،12}.

وتشير الأدلة الحالية إلى أن 5-hmC هو المخصب للغاية في الأنسجة العصبية / الخلايا بالنسبة لأنواع أخرى من الأنسجة في الثدييات، ويعرض الميزات الديناميكية خلال تطوير الخلايا العصبية^13،14. في الجهاز العصبي، 5-hmC بوساطة التعديلات الجينية تلعب دورا هاما في تنظيم الخلايا الجذعية العصبية، والنشاط العصبي، والتعلم والذاكرة، وتشارك في اضطرابات عصبية متعددة بما في ذلك متلازمة ريت، التوحد، الزهايمر المرض، مرض هنتنغتون، الخ^{2،13،15،16،17،18،19،20.}

هناك العديد من النهج للكشف عن 5-hmC في الخلايا والأنسجة^{14،21،22،23،24.} هنا، ونحن نصف طريقتين للكشف عن وجود 5-hmC وكمية المستوى العالمي من 5-hmC: تلطيخ الفلورة المناعية والحمض النووي نقطة وصمة عار. هذه الطريقتين مريحة وحساسة، وقد استخدمت بنجاح في الدراسات السابقة^{25،26،27،28،29،30.} الخطوات الرئيسية لهذين الأسلوبين هي إزالة الحمض النووي. لتلطيخ مناعة 5-hmC، مطلوب المعالجة المسبقة للعينات مع 1 M حمض الهيدروكلوريك. ل5-hmC نقطة وصمة عار، يتم تنفيذ denaturation الحمض النووي مع حل هيدروكسيد الصوديوم. هذه الطريقتين جنبا إلى جنب مع تسلسل الجيل القادم هي أدوات مفيدة جداً للتحقيق في وظيفة 5-hmC.