La detección de 5-Hidroximetilcitosina en células madre neuronales y cerebros de ratones
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para detectar 5-hidroximetilcitosina en células y tejidos cerebrales, utilizando la tinción de inmunofluorescencia y métodos de adn-blot.
Abstract
Se han identificado múltiples modificaciones del ADN en el genoma de los mamíferos. De eso, 5-metilcitosina y 5-hidroximetilcitosina-mediada mecanismos epigenéticos se han estudiado intensamente. 5-hidroximetilcitosina muestra características dinámicas durante el desarrollo embrionario y postnatal del cerebro, desempeña una función reguladora en la expresión génica, y participa en múltiples trastornos neurológicos. Aquí, describimos los métodos detallados incluyendo la tinción de inmunofluorescencia y la mancha de puntos de ADN para detectar 5-hidroximetilcitosina en células cultivadas y tejidos cerebrales de ratón.
Introduction
Se ha demostrado que las modificaciones epigenéticas, incluidas la modificación del ADN, la modificación de la histona y la modificación del ARN, desempeñan funciones esenciales en diversos procesos biológicos y enfermedades1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7. Durante mucho tiempo, la metilación del ADN (es decir, 5-metilcitosina (5-mC)) se ha visto como un marcador epigenético altamente estable y no puede modificarse más en el genoma. Recientemente, se ha encontrado que 5-mC podría ser oxidado a 5-hidroximetilcitosina(5-hmC) por TET (diez-once translocaciones) proteínas de la familia incluyendo TET1, TET2, y TET38,9. Otros estudios muestran que 5-hmC podría servir como un marcador estable y desempeñar funciones biológicas a través de la regulación de la expresión génica4,10,11,12.
Las pruebas actuales indican que 5-hmC está altamente enriquecido en tejidos/células neuronales en relación con otros tipos de tejidos en mamíferos, y exhibe características dinámicas durante el desarrollo neuronal13,14. En el sistema neuronal, las modificaciones epigenéticas mediadas por 5 hmC desempeñan un papel importante en la regulación de las células madre neuronales, la actividad neuronal, el aprendizaje y la memoria, y está implicada en múltiples trastornos neurológicos como el síndrome de Rett, el autismo, la enfermedad de Alzheimer enfermedad, enfermedad de Huntington, etc.2,13,15,16,17,18,19,20.
Existen varios enfoques para detectar 5 hmC en células y tejidos14,21,22,23,24. Aquí, describimos dos métodos para detectar la existencia de 5 hmC y cuantificar el nivel global de 5-hmC: la tinción de inmunofluorescencia y el ADN punto-blot. Estos dos métodos son convenientes y sensibles, y se han utilizado con éxito en estudios anteriores25,26,27,28,29,30. Los pasos clave de estos dos métodos son la desnaturalización del ADN. Para la tinción de inmunofluorescencia de 5 hmC, se requiere el pretratamiento de muestras con 1 M HCl. Para la eliminación de puntos de 5 hmC, la desnaturalización del ADN se realiza con la solución NaOH. Estos dos métodos junto con la secuenciación de próxima generación son herramientas muy útiles para investigar la función de 5 hmC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las modificaciones epigenéticas desempeñan un papel esencial durante el desarrollo cerebral, la maduración y la función. Como marcador estable para la modificación del ADN, la dinámica de 5 hmC responde a la adaptación conductual, la actividad neuronal y está correlacionada positivamente con la expresión génica; por lo tanto, está involucrado en la función normal del cerebro y el trastorno neurológico4. Para explorar su función en células y tejidos, es necesario detectar la existenc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
XL fue apoyado en parte por el Programa Nacional De I+D clave de China (2017YFE0196600), y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 31771395, 31571518). Q.S. contó con el apoyo del Programa Nacional De Investigación y Desarrollo Clave de China (2017YFC1001703) y el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de la Provincia de Zhejiang (2017C03009). W.X. contó con el apoyo de la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Zhejiang (LY18H020002) y el Departamento de Tecnología Científica de la provincia de Zhejiang (2017C37057).
Materials
| 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) | Sigma-Aldrich | D8417 |
| Adobe Photoshop software | Adobe Inc. | / |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A11008 |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A11001 |
| anti-5-hydroxymethylcytosine | Active Motif | 39769 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 |
| B27 supplement | Gibco | 12587-010 |
| B27 supplement | Gibco | 12580-010 |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 |
| Cryostat microtome | Leica | CM1950 |
| DMEM/F-12 medium | OmegaScientific | DM25 |
| epidermal growth factor | PeproTech | 100-15 |
| Fibroblast growth factor-basic | PeproTech | 100-18B |
| forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 |
| GlutaMax | Thermo | 35050061 |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-149 |
| neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
| normal goat serum | Vector Laboratories | Z0325 |
| nylon membrane (Hybond™-N+ ) | Amersham Biosciences | RPN303B |
| OCT | Leica | 14020108926 |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 |
| phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) | Sigma-Aldrich | 516726 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899-10 |
| proteinase K | VVR | 39450-01-6 |
| retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 |
| Triton X-100 | Solarbio | T8210 |
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