JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Deutsch

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Der Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in neuralen Stammzellen und Gehirnen von Mäusen

Published: September 19, 2019
doi:
10.3791/59950
, , , ,
1The Children’s Hospital, School of Medicine,Zhejiang University, 2The Institute of Translational Medicine, School of Medicine,Zhejiang University

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in Zellen und Hirngeweben vor, wobei Immunfluoreszenzfärbungundungen und DNA-Dot-Blot-Methoden verwendet werden.

Abstract

Im Säugetiergenom wurden mehrere DNA-Modifikationen identifiziert. Davon wurden 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin-vermittelte epigenetische Mechanismen intensiv untersucht. 5-Hydroxymethylcytosin zeigt dynamische Merkmale während der embryonalen und postnatalen Entwicklung des Gehirns, spielt eine regulierende Funktion in der Genexpression und ist an mehreren neurologischen Störungen beteiligt. Hier beschreiben wir die detaillierten Methoden einschließlich Immunfluoreszenzfärbung und DNA-Dot-Blot zum Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in kultivierten Zellen und Gehirngeweben der Maus.

Introduction

Epigenetische Modifikationen, einschließlich DNA-Modifikation, Histonmodifikation und RNA-Modifikation, haben gezeigt, dass sie wesentliche Funktionen in verschiedenen biologischen Prozessen und Krankheiten spielen1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7. Lange Zeit wurde die DNA-Methylierung (d.h. 5-Methylcytosin (5-mC)) als hochstabiler epigenetischer Marker angesehen und kann im Genom nicht weiter modifiziert werden. Kürzlich wurde festgestellt, dass 5-mC durch TET-Proteine (Ten-eleven Translokationen) einschließlich TET1, TET2 und TET38,9zu 5-Hydroxymethylcytosin(5-hmC) oxidiert werden könnten. Weitere Studien zeigen, dass 5-hmC als stabiler Marker dienen und biologische Rollen spielen könnte, indem die Genexpression4,10,11,12reguliert wird.

Die vorliegenden Beweise deuten darauf hin, dass 5-hmC in neuronalen Geweben/Zellen im Vergleich zu anderen Gewebearten bei Säugetieren hoch angereichert ist und dynamische Merkmale während der neuronalen Entwicklung13,14aufweist. Im neuronalen System spielen 5-hmC-vermittelte epigenetische Modifikationen eine wichtige Rolle bei der Regulierung neuronaler Stammzellen, neuronaler Aktivität, Lernen und Gedächtnis und sind an mehreren neurologischen Erkrankungen wie Rett-Syndrom, Autismus, Alzheimer beteiligt. Krankheit, Huntington, etc.2,13,15,16,17,18,19,20.

Es gibt mehrere Ansätze zum Nachweis von 5-hmC in Zellen und Geweben14,21,22,23,24. Hier beschreiben wir zwei Methoden, um die Existenz von 5-hmC zu erkennen und das globale Niveau von 5-hmC zu quantifizieren: Immunfluoreszenzfärbung und DNA-Punktfleck. Diese beiden Methoden sind bequem und empfindlich, und wurden erfolgreich in früheren Studien25,26,27,28,29,30verwendet. Die wichtigsten Schritte dieser beiden Methoden sind die DNA-Denaturierung. Für die Immunfluoreszenzfärbung von 5-hmC ist eine Vorbehandlung von Proben mit 1 M HCl erforderlich. Bei 5-hmC Dot-Blot wird die DNA-Denaturierung mit NaOH-Lösung durchgeführt. Diese beiden Methoden sind zusammen mit der Sequenzierung der nächsten Generation sehr nützliche Werkzeuge zur Untersuchung der Funktion von 5-hmC.

Protocol

Alle Tierverfahren wurden von der Tierethikkommission der Universität Zhejiang genehmigt. 1. Die Kultur der adulten neuronalen Stammzellen und Neuronen Isolieren Sie adulte neuronale Stammzellen aus dem Vorderhirn einer Erwachsenen (8-10 Wochen alt) C57/BL6 männliche Maus wie zuvor beschrieben31,32. Kultur adulte neuronale Stammzellen in DMEM/F-12 Medium mit 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27-Ergänzung, 1% Anti…

Representative Results

Um die Verteilung von 5-hmC im Hippocampus von erwachsenen Mäusen zu zeigen, führten wir Immunfluoreszenz mit Antikörpern gegen neuronale Zellen (NeuN) und 5-hmC durch. Im Hippocampus, 5-hmC ko-lokalisiert gut mit neuronalen Zellmarker NeuN (Abbildung 1A-H), was auf eine Anreicherung von 5-hmC in Neuronen. Um die Dynamik von 5-hmC während der neuronalen Entwicklung zu bestimmen, wurde zuerst ein Punktblot mit DNA-Proben durchgeführt, die aus …

Discussion

Epigenetische Modifikationen spielen eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung, Reifung und Funktion des Gehirns. Als stabiler Marker für die DNA-Modifikation reagiert dynamisches 5-hmC auf Verhaltensanpassung, neuronale Aktivität und ist positiv mit der Genexpression korreliert; somit ist es an der normalen Funktion des Gehirns und der neurologischen Störungbeteiligt 4. Um seine Funktion in Zellen und Geweben zu erforschen, ist es notwendig, die Existenz von 5-hmC zu erkennen und den Pegel vo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

XL wurde teilweise vom National Key R&D Program of China (2017YFE0196600) und der National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 31771395, 31571518) unterstützt. Q.S. wurde vom National Key Research and Development Program of China (2017YFC1001703) und dem Key Research and Development Program der Provinz Zhejiang (2017C03009) unterstützt. W.X. wurde von der Natural Science Foundation der Provinz Zhejiang (LY18H020002) und der Abteilung für Wissenschaftstechnologie der Provinz Zhejiang (2017C37057) unterstützt.

Materials

4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) Sigma-Aldrich D8417
Adobe Photoshop software Adobe Inc. /
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher A11008
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher A11001
anti-5-hydroxymethylcytosine Active Motif 39769
anti-NeuN Millipore MAB377
B27 supplement Gibco 12587-010
B27 supplement Gibco 12580-010
B27 supplement Gibco 17504-044
Cryostat microtome Leica CM1950
DMEM/F-12 medium OmegaScientific DM25
epidermal growth factor PeproTech 100-15
Fibroblast growth factor-basic PeproTech 100-18B
forskolin Sigma-Aldrich F6886
GlutaMax Thermo 35050061
L-Glutamine Gibco 25030-149
neurobasal medium Gibco 21103-049
normal goat serum Vector Laboratories Z0325
nylon membrane (Hybond™-N+ ) Amersham Biosciences RPN303B
OCT Leica 14020108926
Pen Strep Gibco 15140-122
phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) Sigma-Aldrich 516726
Poly-D-Lysine Sigma P0899-10
proteinase K VVR 39450-01-6
retinoic acid Sigma-Aldrich R2625
Triton X-100 Solarbio T8210
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tan, L., Shi, Y. G. Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease. Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).
  2. Yao, B., et al. Epigenetic mechanisms in neurogenesis. Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).
  3. Day, J. J., Sweatt, J. D. DNA methylation and memory formation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).
  4. Wu, X. J., Zhang, Y. TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond. Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).
  5. Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. 5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development. Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).
  6. Li, S., Mason, C. E. The pivotal regulatory landscape of RNA modifications. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).
  7. Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection. Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).
  8. Kriaucionis, S., Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324 (5929), 929-930 (2009).
  9. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
  10. Guo, J. U., et al. Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain. Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).
  11. Feng, J., et al. Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons. Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).
  12. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Geneticset. , 245-254 (2003).
  13. Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).
  14. Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
  15. Shu, L. Q., et al. Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer’s disease. BMC Genomics. 17, (2016).
  16. Cruvinel, E., et al. Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs. Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).
  17. Bernstein, A. I., et al. 5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer’s disease modulate Tau-induced neurotoxicity. Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).
  18. Wang, F. L., et al. Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease. Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).
  19. Yu, H., et al. Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair. Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).
  20. Wu, H., Zhang, Y. Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions. Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).
  21. Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341 (6146), 1237905 (2013).
  22. Inoue, A., Zhang, Y. Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
  23. Pastor, W. A., et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).
  24. Ito, S., et al. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466 (7310), (2010).
  25. Wang, T., et al. Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum. Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).
  26. Song, C. X., et al. Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine. Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).
  27. Wang, T., et al. Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency. Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).
  28. Li, X., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, 15903 (2017).
  29. Szulwach, K. E., et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).
  30. Tao, H., et al. The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2018, 2186301 (2018).
  31. Li, X. K., et al. Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis. Nature Communications. 8, (2017).
  32. Li, X., et al. Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells. Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).
  33. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).

Tags

5-hydroxymethylcytosine5hmCImmunofluorescenceDNA Dot-blotNeural Stem CellsMouse BrainEpigenetic ModificationGene ExpressionNeurological DisordersPerfusionFixationCryosectioningImmunostaining

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhuang, Y., Chen, J., Xu, W., Shu, Q., Li, X. The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice. J. Vis. Exp. (151), e59950, doi:10.3791/59950 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image