Rening av högavkastande extracellulära vesikel preparat bort från virus

Forskning centrerad kring extracellulära blåsor (EVs), specifikt exosomes, en typ av EV som sträcker sig 30-120 Nm och kännetecknas av närvaron av tre tetraspanin markörer CD81, CD9, och CD63, har till stor del formats av utvecklingen av metoder för att isolera och rena vesiklarna av intresse. Förmågan att dissekera mångfacetterade mekanismer har hindrats på grund av komplicerade och tidskrävande tekniker som genererar prover som består av en heterogen population av vesikler som genereras via olika vägar med ett brett spektrum av innehåll, storlekar och Tätheter. Även om detta är en fråga för nästan alla EV forskning, det är av särskild betydelse när man studerar EVs i samband med virusinfektion, som virioner och virusliknande partiklar (VLPs) kan vara liknande i diameter till vesikler av intresse. Till exempel, humant immunbrist virus typ 1 (HIV-1) är cirka 100 nm i diameter, vilket är ungefär samma storlek som många typer av EVs. Därför har vi utformat ett nytt EV-isolerings arbetsflöde för att lösa dessa problem.

Den nuvarande Guldstandarden för EV isolering är ultracentrifugation. Denna teknik utnyttjar de olika vesikeldensiteterna, vilket gör att vesiklarna kan separeras genom centrifugering med differentiell sedimentering av partiklar med högre densitet jämfört med partiklar med lägre densitet vid varje etapp ^1,2. Flera lågfart centrifugering steg krävs för att ta bort intakt celler (300-400 x g för 10 min), cellfragment (~ 2 000 x g för 10 min), och apoptotiska organ/stora blåsor (~ 10 000 x g för 10 min). Dessa initiala reningar följs av hög hastighet ultracentrifugering (100000-200000 x g för 1.5-2 h) till sediment EVS. Tvätta steg utförs för att ytterligare säkerställa EV renhet, men detta resulterar i en minskning av antalet isolerade EVS, vilket sänker den totala avkastningen ^3,4. Denna metodens nytta begränsas ytterligare av kravet på ett stort antal celler (ca 1 x 10⁸) och en stor provvolym (≫ 100 ml) för att uppnå tillräckliga resultat.

För att ta itu med den växande oron har utfällning av vesikler med hydrofila polymerer blivit en användbar teknik under de senaste åren. Polyetylenglykol (PEG), eller andra relaterade nederbörd reagens, gör det möjligt för användaren att dra ner blåsor, virus, och protein eller protein-RNA aggregat i ett prov genom att helt enkelt inkuberar provet med reagens val, följt av en enda låg hastighet centrifugering^1,2,5. Vi har tidigare rapporterat att användning av PEG eller relaterade metoder för att fälla ut EVS i jämförelse med traditionell ultracentrifugering resulterar i en betydligt högre avkastning⁶. Denna strategi är snabb, lätt, inte kräver extra dyr utrustning, är lätt skalbar, och behåller EV struktur. Men på grund av den promiskuösa karaktären hos denna metod, de resulterande proverna innehåller en mängd olika produkter, inklusive fria proteiner, proteinkomplex, en rad EVs, och virioner vilket kräver ytterligare rening för att få önskad population^{1 ,2,7,8}.

För att övervinna heterogenitet av EVS erhålls från olika nederbörd metoder, densitet gradient ultracentrifugering (DG) utnyttjas för att bättre separera partiklar baserat på deras densitet. Denna metod utförs med hjälp av en stegvis gradient med hjälp av en densitet gradient medium, såsom iodixanol eller sackaros, som gör det möjligt för separation av EVs från proteiner, proteinkomplex, och virus eller virusliknande partiklar (VLPs). Det är viktigt att notera att även om det var en gång trodde att DG tillät mer exakt separation av EV subpopulationer, är det nu känt att storlekar och densiteter av olika blåsor kan överlappa varandra. Till exempel, exosomer är kända för att ha flotationdensiteter på 1,08-1,22 g/ml⁹, medan vesikler isolerade från Golgi (COPI⁺ eller proteinet⁺) har densiteter på 1,05-1,12 g/ml och de från endoplasmatiska Retikulum (copii⁺ ) sediment vid 1,18-1,25 g/ml^1,2,3,4,9. Dessutom, om man önskar att jämföra exosomala fraktioner mot fraktioner som innehåller viruspartiklar, detta kan bli svårare beroende på tätheten av viruset av intresse-det finns virus än hiv-1 som sannolikt jämvikt på samma densiteter som exosomalt positiva fraktioner².

Slutligen, anrikning av EV Preps för nedströms visualisering och funktionella analyser är avgörande för EV forskning. Användningen av EV-berikande nanopartiklar, särskilt multifunktionella hydrogel partiklar som spänner 700-800 nm i diameter, är ett kritiskt steg för att uppnå koncentrerad EV Preps. De besitter en hög affinitet aromatiska bete som inkapslade av en porös yttre siktning skal för att främja selektivitet. De nanopartiklar som används i denna studie omfattar två distinkta preparat med olika kärn beten (reaktiv röd 120 NT80; och Cibacron Blue F3GA NT82) som har visat sig öka fångsten av EVs från olika reagenser och biofluider (se tabellen över material )^{6,10,11,12,13,14,15}. Partiklarna erbjuder enkel anrikning av EVS från många utgångsmaterial inklusive iodixanol fraktioner, cellkultur supernatant, samt patient biofluider såsom plasma, serum, cerebral spinal vätskor (CSF), och urin^6,13 .

Den metod som presenteras här förbättrar effektiviteten i nuvarande EV reningsteknik genom att kombinera flera tekniker; EV nederbörd, densitet lutning ultracentrifugation, och partikelavskiljning, att effektivisera arbetsflödet, minska provkraven, och öka avkastningen för att få en mer homogen EV prov för användning i all EV forskning. Denna metod är särskilt användbar i undersökningen av EVs och deras innehåll under virusinfektion eftersom det innehåller ett 0,22 μm filtrerings steg för att utesluta stora, oönskade blåsor och VLPs och separation av den totala EV populationen baserat på densitet för att effektivt isolera EVs från virions.