Purificação de preparações de vesículas extracelulares de alto rendimento longe do vírus

Pesquisa centrada em torno de vesículas extracelulares (EVs), especificamente exosomas, um tipo de EV variando 30-120 nm e caracterizada pela presença de três marcadores de tetraspanina CD81, CD9 e CD63, tem sido largamente moldado pelo desenvolvimento de métodos para isolar e purificar as vesículas de interesse. A capacidade de dissecar mecanismos multifacetados tem sido dificultada devido a técnicas complexas e demoradas que geram amostras compostas por uma população heterogênea de vesículas geradas através de diferentes vias com uma ampla gama de conteúdos, tamanhos e Densidades. Embora esta seja uma questão para quase todas as pesquisas EV, é de particular importância ao estudar EVs no contexto da infecção viral, como virions e vírus-como partículas (VLPs) pode ser semelhante em diâmetro para as vesículas de interesse. Por exemplo, o tipo 1 do vírus de imunodeficiência humana (HIV-1) é aproximadamente 100 nanômetro no diâmetro, que é aproximadamente o mesmo tamanho que muitos tipos de EVs. Por esse motivo, projetamos um novo fluxo de trabalho de isolamento de EV para abordar esses problemas.

O padrão ouro atual de isolamento EV é ultracentlee. Esta técnica faz uso das várias densidades da vesícula, o que permite que as vesículas sejam separadas por centrifugação com sedimentação diferencial de partículas de maior densidade versus partículas de menor densidade em cada etapa ^1,2. Várias etapas de centrifugação de baixa velocidade são necessárias para remover células intactas (300-400 x g por 10 min), detritos celulares (~ 2.000 x g por 10 min) e corpos apoptóticos/grandes vesículas (~ 10.000 x g por 10 min). Estas purificações iniciais são seguidas por ultracentlee de alta velocidade (100000-200000 x g para 1.5-2 h) aos EVS do sedimento. As etapas da lavagem são executadas para assegurar mais a pureza do EV, entretanto, isto conduz à redução do número de EVS isolados, assim abaixando o rendimento total ^3,4. O utilitário deste método é ainda mais limitado pela exigência de um grande número de células (aproximadamente 1 x 10⁸) e um grande volume amostral (≫ 100 ml) para alcançar resultados adequados.

Para abordar as crescentes preocupações, a precipitação de vesículas com polímeros hidrofílicos tornou-se uma técnica útil nos últimos anos. O polietileno glicol (PEG), ou outros reagentes relacionados da precipitação, permite que o usuário puxe para baixo as vesículas, os vírus, e os agregados da proteína ou do proteína-RNA dentro de uma amostra simplesmente incubando a amostra com o reagente da escolha, seguido por um único de baixa velocidade centrifugação^1,2,5. Nós temos relatado previamente que o uso do PEG ou de métodos relacionados para precipentar EVs em comparação com os resultados tradicionais do ultracentlee em um rendimento significativamente mais elevado⁶. Esta estratégia é rápida, fácil, não requer equipamentos caros adicionais, é prontamente escalável, e retém a estrutura EV. No entanto, devido à natureza promíscuo deste método, as amostras resultantes contêm uma variedade de produtos, incluindo proteínas livres, complexos proteicos, uma gama de EVs, e virions, assim, exigindo mais purificação para obter a população desejada^{1 ,2,7,8}.

Para superar a heterogeneidade de EVs obtidos de vários métodos da precipitação, o ultracentlee do inclinação da densidade (DG) é utilizado para separar melhor partículas baseadas em sua densidade. Este método é realizado usando um gradiente Stepwise usando um meio de gradiente de densidade, como iodixanol ou sacarose, que permite a separação de EVs de proteínas, complexos proteicos, e vírus ou vírus-como partículas (VLPs). É importante notar que, embora já tenha sido pensado que a DG permitiu a separação mais precisa das subpopulações de EV, sabe-se agora que os tamanhos e densidades de várias vesículas podem se sobrepor. Por exemplo, os exosomas são conhecidos por terem densidades de flotação de 1,08-1,22 g/mL⁹, enquanto as vesículas isoladas do GOLGI (copi⁺ ou clathrin⁺) têm densidades de 1,05-1,12 g/ml e as do retículo endoplasmático (copii⁺ ) sedimento em 1,18-1,25 g/ml^1,2,3,4,9. Adicionalmente, se um deseja comparar frações exosomal de encontro às frações que contêm partículas virais, esta pode tornar-se mais difícil depender em cima da densidade do vírus do interesse-há uns vírus à excepção do HIV-1 que equilibram provável ao mesmo densidades como frações positivas exosomáticas².

Finalmente, o enriquecimento de EV Preps para visualização a jusante e ensaios funcionais é vital para a pesquisa EV. O uso de nanopartículas enriquecedora de EV, especificamente, partículas de hidrogel multifuncionais que variam 700-800 nm de diâmetro, são um passo crítico na obtenção de Preps concentrados de EV. Possuem uma isca aromática da afinidade elevada que encapsulado por um escudo de peneiramento exterior poroso para promover o selectivity. As nanopartículas utilizadas neste estudo incluem duas preparações distintas com diferentes iscas de núcleo (vermelho reactivo 120 NT80; e cibacron Blue F3GA NT82) que demonstraram aumentar a captação de EVS de vários reagentes e biofluídos (ver a tabela de materiais )^{6,10,11,12,13,14,15}. As partículas oferecem o enriquecimento fácil dos EVS dos materiais começando numerosos que incluem frações do iodixanol, sobrenadante da cultura de pilha, assim como biofluídos pacientes tais como o plasma, o soro, os líquidos espinais cerebrais (CSF), e a urina^6,13 .

O método aqui apresentado melhora a eficiência das técnicas atuais de purificação de EV, combinando várias tecnologias; Precipitação EV, ultracentlee gradiente de densidade, e captura de partículas, para agilizar o fluxo de trabalho, reduzir os requisitos da amostra, e aumentar o rendimento para obter uma amostra EV mais homogênea para uso em todas as pesquisas EV. Este método é particularmente útil na investigação de EVs e seu conteúdo durante a infecção viral, pois inclui um passo de filtração de 0,22 μm para excluir vesículas grandes, indesejadas e VLPs e separação da população total de EV com base na densidade para efetivamente isolar EVs de virions.