يعزل هذا البروتوكول الحويصلات خارج الخلية (EVs) بعيدا ً عن virions ذات الكفاءة العالية والغلة من خلال دمج هطول الأمطار EV، وكثافة تدرج ultracentrifugation، والتقاط الجسيمات للسماح لسير عمل مبسط والحد من بدء متطلبات الحجم، مما أدى إلى الاستعدادات القابلة للاستنساخ لاستخدامها في جميع البحوث EV.
واحدة من العقبات الرئيسية في مجال أبحاث الحويصلة خارج الخلية (EV) اليوم هو القدرة على تحقيق الاستعدادات EV تنقية في إعداد العدوى الفيروسية. والمقصود من الطريقة المعروضة عزل المركبات الكهربائية بعيدا عن virions (أي فيروس نقص المناعة البشرية-1)، مما يسمح بكفاءة أعلى وغلة أعلى بالمقارنة مع الأساليب التقليدية فائقة التثخاف. بروتوكولنا يحتوي على ثلاث خطوات: هطول الأمطار EV، فصل تدرج الكثافة، والتقاط الجسيمات. يمكن تشغيل الاختبارات النهائية (أي اللطخة الغربية، وPCR) مباشرة بعد التقاط الجسيمات. هذه الطريقة مفيدة على طرق العزل الأخرى (أي ultracentrifugation) كما أنه يسمح لاستخدام الحد الأدنى من وحدات التخزين الأولية. وعلاوة على ذلك، فهو أكثر سهولة للمستخدم من أساليب عزل EV البديلة التي تتطلب خطوات متعددة فائقة التثاقل. ومع ذلك، فإن الطريقة المعروضة محدودة في نطاق اختبارات EV الوظيفية حيث أنه من الصعب أن elute EVs سليمة من جزيئاتنا. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة مصممة خصيصاً لتهيئة بيئة قائمة على البحوث بحتة ولن تكون مجدية تجارياً.
تركز البحث حول الحويصلات خارج الخلية (EVs)، وعلى وجه التحديد exosomes، وهو نوع من EV تتراوح بين 30-120 نانومتر وتتميز بوجود ثلاثة علامات تيتراسبانين CD81، CD9، وCD63، وقد شكلت إلى حد كبير من خلال تطوير أساليب لعزل و تنقية الحويصلات من الفائدة. وقد أعيقت القدرة على تشريح الآليات المتعددة الأوجه بسبب التقنيات المعقدة والمستهلكة للوقت التي تولد عينات تتألف من مجموعة غير متجانسة من الحويصلات المتولدة عبر مسارات مختلفة مع مجموعة واسعة من المحتويات والأحجام، و الكثافه. في حين أن هذه مسألة لجميع البحوث EV تقريبا، فإنه من أهمية خاصة عند دراسة المركبات الكهربائية في سياق العدوى الفيروسية، كما virions والجسيمات الشبيهة بالفيروس (VLPs) يمكن أن تكون مماثلة في القطر إلى الحويصلات ذات الأهمية. فعلى سبيل المثال، يبلغ قطر فيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 (HIV-1) حوالي 100 نانومتر، وهو تقريبا نفس حجم العديد من أنواع المركبات الكهربائية. لهذا السبب، قمنا بتصميم سير عمل عزل EV جديد لمعالجة هذه المشكلات.
المعيار الذهبي الحالي لعزل EV هو فائق التحامل. هذه التقنية تستفيد من مختلف الكثافات الحويصلة، مما يسمح للحويصلات أن تكون مفصولة بالطرد المركزي مع الترسيب التفاضلي للجسيمات ذات الكثافة العالية مقابل جزيئات الكثافة المنخفضة في كل مرحلة 1،2. وهناك عدة خطوات الطرد المركزي منخفضة السرعة مطلوبة لإزالة الخلايا السليمة (300-400 × ز لمدة 10 دقائق)، وحطام الخلايا (~ 2000 × ز لمدة 10 دقائق)، والهيئات المبرمجة / الحويصلات الكبيرة (~ 10،000 × ز لمدة 10 دقائق). ويلي عمليات التنقية الأولية هذه عمليات الإزالة الفائقة السرعة العالية (000 100-000 200 x ز لمدة 1.5-2 ساعة) إلى المركبات الكهربائية للرواسب. يتم تنفيذ خطوات غسل لمزيد من ضمان نقاء EV، ومع ذلك، وهذا يؤدي إلى خفض عدد المركبات الكهربائية المعزولة، وبالتالي خفض العائد الإجمالي 3،4. كما أن فائدة هذه الطريقة محدودة بسبب متطلبات عدد كبير من الخلايا (حوالي 1 × 108) وحجم عينة كبير (> 100 مل) لتحقيق نتائج كافية.
ولمعالجة الشواغل المتزايدة، أصبح هطول الأمطار من الحويصلات مع البوليمرات المائية تقنية مفيدة في السنوات الأخيرة. البولي ايثيلين غليكول (PEG)، أو غيرها من الكواشف هطول الأمطار ذات الصلة، يسمح للمستخدم لسحب أسفل الحويصلات، والفيروسات، والبروتين أو البروتين الحمض النووي الريبي المجاميع داخل عينة ببساطة عن طريق احتضان العينة مع الكواشف من الاختيار، تليها واحدة منخفضة السرعة الطرد المركزي1،2،5. لقد أبلغنا سابقا أن استخدام PEG أو الأساليب ذات الصلة لتسريع المركبات الكهربائية بالمقارنة مع نتائج ultracentrifugation التقليدية في عائد أعلى بكثير6. هذه الاستراتيجية سريعة وسهلة، لا تتطلب معدات إضافية باهظة الثمن، ويمكن تطويرها بسهولة، ويحتفظ هيكل EV. ومع ذلك، ونظرا لطبيعة منحرفة من هذه الطريقة، والعينات الناتجة تحتوي على مجموعة متنوعة من المنتجات بما في ذلك البروتينات الحرة، ومجمعات البروتين، ومجموعة من المركبات الكهربائية، وبالتالي تتطلب المزيد من تنقية للحصول على السكانالمطلوب1 ،2،7،8.
وللتغلب على عدم تجانس المركبات الكهربائية التي تم الحصول عليها من مختلف أساليب هطول الأمطار، يُستخدم تدرج الكثافة الفائق (DG) لفصل الجسيمات على نحو أفضل استناداً إلى كثافتها. يتم تنفيذ هذه الطريقة باستخدام تدرج تدريجي باستخدام وسيط تدرج الكثافة، مثل iodixanol أو السكروز، والذي يسمح لفصل المركبات الكهربائية من البروتينات، ومجمعات البروتين، وجزيئات تشبه الفيروس أو الفيروس (VLPs). ومن المهم ملاحظة أنه في حين كان يعتقد في وقت من الأوقات أن المديرية العامة سمحت بفصل أكثر دقة بين التجمعات السكانية الفرعية للEV، فمن المعروف الآن أن الأحجام والكثافات من الحويصلات المختلفة يمكن أن تتداخل. على سبيل المثال، من المعروف أن exosomes لديها كثافات التعويم من 1.08-1.22 غرام / مل9،في حين أن الحويصلات المعزولة من غولجي (COPI+ أو clathrin+) لديها كثافات من 1.05-1.12 غرام / مل وتلك من الشبكية endoplasmic (COPII+ ) الرواسب في 1.18-1.25 غرام / مل1،2،3،4،9. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان المرء يرغب في مقارنة الكسور الخارجية مع الكسور التي تحتوي على الجسيمات الفيروسية، وهذا قد يصبح أكثر صعوبة اعتمادا على كثافة الفيروس من الفائدة – هناك فيروسات أخرى غير فيروس نقص المناعة البشرية-1 التي من المرجح أن توازن في نفس الكثافات والكسور الإيجابية الخارجية2.
وأخيرا، فإن إثراء الإعدادية EV للتصور المصب والاختبارات الوظيفية أمر حيوي لبحوث EV. استخدام الجسيمات النانوية التي تثري EV، وعلى وجه التحديد، جزيئات هيدروجيل متعددة الوظائف التي تتراوح بين 700-800 نانومتر في القطر، هي خطوة حاسمة في تحقيق الإعدادية EV المركزة. أنها تمتلك طعم العطرية تقارب عالية التي مغلفة بقذيفة غرب مسامية غرب المنال لتعزيز الانتقائية. وتشمل الجسيمات النانوية المستخدمة في هذه الدراسة إعدادين متميزين مع طعوم أساسية مختلفة (رد الفعل الأحمر 120 NT80؛ وCibacron Blue F3GA NT82) التي أظهرت زيادة التقاط المركبات الكهربائية من مختلف الكواشف والسوائل الحيوية (انظر جدول المواد )6،10،11،12،13،14،15. الجسيمات توفر سهولة إثراء المركبات الكهربائية من العديد من المواد بدءا بما في ذلك كسور iodixanol، supernatant ثقافة الخلية، فضلا عن السوائل الحيوية المريض مثل البلازما، المصل، السوائل الشوكية الدماغية (CSF)، والبول6،13 .
الطريقة المعروضة هنا يحسن كفاءة تقنيات تنقية EV الحالية من خلال الجمع بين العديد من التكنولوجيات; EV هطول الأمطار، كثافة التدرج ultracentrifugation، والتقاط الجسيمات، لتبسيط سير العمل، والحد من متطلبات العينة، وزيادة العائد للحصول على عينة EV أكثر تجانسا للاستخدام في جميع البحوث EV. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص في التحقيق في المركبات الكهربائية ومحتوياتها خلال العدوى الفيروسية كما أنه يتضمن خطوة ترشيح 0.22 ميكرومتر لاستبعاد الحويصلات الكبيرة وغير المرغوب فيها وVLPs والفصل بين مجموع السكان EV على أساس الكثافة إلى فعالية عزل المركبات الكهربائية من virions.
تسمح الطريقة الموضحة بتعزيز عائد EV وفصل الفيروس عن المركبات الكهربائية باستخدام نهج مركب للعزل. يمكن تصفية كميات كبيرة نسبيا من المواد الأولية (أي الخلية الفائقة) قبل عزل EV عن طريق هطول الأمطار، وفصل DG، وإثراء الجسيمات النانوية، مما يؤدي إلى حجم نهائي قدره ~ 30 درجة مئوية، مما يسمح للاستخدا…
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر جميع أعضاء مختبر كاشانشي، وخاصة جوين كوكس. وقد تم دعم هذا العمل بمنح المعاهد الوطنية للصحة (AI078859، AI074410، AI127351-01، AI043894، وNS099029 إلى F.K.).
CEM CD4+ Cells | NIH AIDS Reagent Program | 117 | CEM |
DPBS without Ca and Mg (1X) | Quality Biological | 114-057-101 | |
ExoMAX Opti-Enhancer | Systems Biosciences | EXOMAX24A-1 | PEG precipitation reagent |
Exosome-Depleted FBS | Thermo Fisher Scientific | A2720801 | |
Fetal Bovine Serum | Peak Serum | PS-FB3 | Serum |
HIV-1 infected U937 Cells | NIH AIDS Reagent Program | 165 | U1 |
Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA | Thermo Scientific | 723-2520 | |
Nanotrap (NT80) | Ceres Nanosciences | CN1030 | Reactive Red 120 core |
Nanotrap (NT82) | Ceres Nanosciences | CN2010 | Cibacron Blue F3GA core |
Optima XE-980 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250mL | Iodixanol |
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
Ultra-Clear Tube, 14x89mm | Beckman Coulter | 344059 |