Summary

Reinigung von hochertragreichen extrazellulären Vesikelpräparaten weg vom Virus

Published: September 12, 2019
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Summary

Dieses Protokoll isoliert extrazelluläre Vesikel (EVs) von Virionen mit hoher Effizienz und Ausbeute, indem EV-Fällung, Dichtegradient-Ultrazentrifugation und Partikelerfassung integriert werden, um einen optimierten Workflow und eine Reduzierung des Startens zu ermöglichen. Mengenanforderungen, die zu reproduzierbaren Präparaten für den Einsatz in allen EV-Forschungen führen.

Abstract

Eine der größten Hürden auf dem Gebiet der extrazellulären Vesikelforschung (EV) ist heute die Fähigkeit, gereinigte EV-Präparate in einer Virusinfektion zu erreichen. Die vorgestellte Methode soll Elektrofahrzeuge von Virionen (d. h. HIV-1) abisolaten und eine höhere Effizienz und Ausbeute im Vergleich zu herkömmlichen Ultrazentrifugationsmethoden ermöglichen. Unser Protokoll enthält drei Schritte: EV-Ausfällung, Dichtegradiententrennung und Partikelerfassung. Downstream-Assays (z. B. Western Blot und PCR) können direkt nach der Partikelerfassung ausgeführt werden. Diese Methode ist vorteilhaft gegenüber anderen Isolationsmethoden (d. h. Ultrazentrifugation), da sie die Verwendung von minimalen Startvolumina ermöglicht. Darüber hinaus ist es benutzerfreundlicher als alternative EV-Isolationsmethoden, die mehrere Ultrazentrifugationsschritte erfordern. Die vorgestellte Methode ist jedoch in ihrem Umfang an funktionellen EV-Assays begrenzt, da es schwierig ist, intakte Elektrofahrzeuge aus unseren Partikeln zu entfernen. Darüber hinaus ist diese Methode auf einen rein forschungsbasierten Rahmen zugeschnitten und wäre kommerziell nicht rentabel.

Introduction

Die Forschung, die sich auf extrazelluläre Vesikel (EVs) konzentriert, insbesondere Exosomen, eine Art von EV im Bereich 30-120 nm und gekennzeichnet durch das Vorhandensein von drei Tetraspanin-Markern CD81, CD9 und CD63, wurde weitgehend durch die Entwicklung von Methoden zur Isolierung und die Vesikel von Interesse zu reinigen. Die Fähigkeit, vielfältige Mechanismen zu dissektieren, wurde durch komplexe und zeitaufwändige Techniken behindert, die Proben erzeugen, die aus einer heterogenen Population von Vesikeln bestehen, die über verschiedene Wege mit einer Vielzahl von Inhalten, Größen und Dichten. Während dies ein Problem für fast die gesamte EV-Forschung ist, ist es von besonderer Bedeutung bei der Untersuchung von Elektrofahrzeugen im Zusammenhang mit Virusinfektionen, da Virionen und virusähnliche Partikel (VLPs) im Durchmesser den Vesikeln von Interesse ähnlich sein können. Zum Beispiel hat das Human Immunodeficiency Virus Typ 1 (HIV-1) einen Durchmesser von etwa 100 nm, was ungefähr der Größe vieler Arten von Elektrofahrzeugen entspricht. Aus diesem Grund haben wir einen neuartigen EV-Isolations-Workflow entwickelt, um diese Probleme anzugehen.

Der aktuelle Goldstandard der EV-Isolierung ist die Ultrazentrifugation. Diese Technik nutzt die verschiedenen Vesikeldichten, die es ermöglichen, die Vesikel durch Zentrifugation mit Differentialsedimentation von Partikeln mit höherer Dichte im Vergleich zu Partikeln mit niedrigerer Dichte in jeder Stufe 1,2zu trennen. Mehrere Mittel zur Zentrifugierung mit niedriger Geschwindigkeit sind erforderlich, um intakte Zellen (300-400 x g für 10 min), Zellablagerungen (für 10 min) und apoptotische Körper/große Vesikel (10.000 x g für 10 min) zu entfernen. Auf diese anfänglichen Reinigungen folgt eine Hochgeschwindigkeits-Ultrazentrifugation (100.000-200.000 x g für 1,5-2 h) zu Sediment-EVs. Waschschritte werden durchgeführt, um die Reinheit der Evev weiter zu gewährleisten, dies führt jedoch zur Verringerung der Anzahl isolierter Elektrofahrzeuge, wodurch die Gesamtausbeute 3,4verringert wird. Der Nutzen dieser Methode wird durch den Bedarf an einer großen Anzahl von Zellen (ca. 1 x 108) und einem großen Probenvolumen (> 100 ml) weiter eingeschränkt, um angemessene Ergebnisse zu erzielen.

Um den wachsenden Bedenken Rechnung zu tragen, ist die Fällung von Vesikeln mit hydrophilen Polymeren in den letzten Jahren zu einer nützlichen Technik geworden. Polyethylenglykol (PEG) oder andere verwandte Niederschlagsreagenzien ermöglichen es dem Anwender, die Vesikel, Viren und Protein- oder Protein-RNA-Aggregate innerhalb einer Probe herunterzuziehen, indem die Probe einfach mit dem Reagenz der Wahl inkubiert wird, gefolgt von einer einzigen Zentrifugation1,2,5. Wir haben bereits berichtet, dass die Verwendung von PEG oder verwandten Methoden zur Ausscheidung von Elektrofahrzeugen im Vergleich zur herkömmlichen Ultrazentrifugation zu einer deutlich höheren Ausbeute6führt. Diese Strategie ist schnell, einfach, erfordert keine zusätzliche teure Ausrüstung, ist leicht skalierbar und behält die EV-Struktur bei. Aufgrund des promiskuitiven Charakters dieser Methode enthalten die resultierenden Proben jedoch eine Vielzahl von Produkten, darunter freie Proteine, Proteinkomplexe, eine Reihe von Elektrofahrzeugen und Virionen, die eine weitere Reinigung erfordern, um die gewünschte Population zu erhalten1 ,2,7,8.

Um die Heterogenität von Elektrofahrzeugen zu überwinden, die aus verschiedenen Niederschlagsmethoden gewonnen werden, wird die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation (DG) genutzt, um Partikel auf der Grundlage ihrer Dichte besser zu trennen. Diese Methode wird mit einem stufenweisen Gradienten unter Verwendung eines Dichtegradientenmediums wie Iodixanol oder Saccharose durchgeführt, das die Trennung von Elektrofahrzeugen von Proteinen, Proteinkomplexen und virus- oder virusähnlichen Partikeln (VLPs) ermöglicht. Es ist wichtig zu beachten, dass, obwohl man einst dachte, dass die DG eine genauere Trennung der EV-Subpopulationen zulässt, es heute bekannt ist, dass sich Größen und Dichten verschiedener Vesikel überschneiden können. So haben Exosomen bekanntermaßen Flotationsdichten von 1,08-1,22 g/ml9, während aus dem Golgi isolierte Vesikel (COPI+ oder Clathrin+) Dichten von 1,05-1,12 g/ml und solche aus dem endoplasmatischen Retikulum (COPII+ ) Sediment bei 1,18-1,25 g/mL1,2,3,4,9. Wenn man exosomale Fraktionen mit Fraktionen vergleichen möchte, die Viruspartikel enthalten, kann dies je nach Dichte des Virus von Interesse schwieriger werden – es gibt andere Viren als HIV-1, die wahrscheinlich gleichzeitig ausgleichen. Dichte als exosomale positive Fraktionen2.

Schließlich ist die Anreicherung von EV-Preps für nachgelagerte Visualisierungen und funktionelle Assays für die EV-Forschung von entscheidender Bedeutung. Die Verwendung von EV-anreichernden Nanopartikeln, insbesondere multifunktionalen Hydrogelpartikeln mit einem Durchmesser von 700-800 nm, ist ein entscheidender Schritt zur Erreichung konzentrierter EV-Preps. Sie besitzen einen aromatischen Köder mit hoher Affinität, der von einer porösen äußeren Siebschale gekapselt wird, um die Selektivität zu fördern. Zu den in dieser Studie verwendeten Nanopartikeln gehören zwei unterschiedliche Präparate mit unterschiedlichen Kernködern (Reactive Red 120 NT80 und Cibacron Blue F3GA NT82), die nachweislich die Erfassung von Elektrofahrzeugen aus verschiedenen Reagenzien und Biofluiden erhöhen (siehe Tabelle der Materialien). )6,10,11,12,13,14,15. Die Partikel bieten eine einfache Anreicherung von Elektrofahrzeugen aus zahlreichen Ausgangsmaterialien, darunter Iodixanolfraktionen, Zellkulturüberstand, sowie Patientenbiofluide wie Plasma, Serum, zerebrale Rückenmarksflüssigkeiten (CSF) und Urin6,13 .

Die hier vorgestellte Methode verbessert die Effizienz der aktuellen EV-Reinigungstechniken durch die Kombination mehrerer Technologien; EV-Fällung, Dichtegradienten-Ultrazentrifugation und Partikelerfassung, um den Workflow zu optimieren, die Probenanforderungen zu reduzieren und die Ausbeute zu erhöhen, um eine homogenere EV-Probe für den Einsatz in allen EV-Forschungen zu erhalten. Diese Methode ist besonders nützlich bei der Untersuchung von Elektrofahrzeugen und deren Inhalt während einer Virusinfektion, da sie einen Filterschritt von 0,22 m umfasst, um große, unerwünschte Vesikel und VLPs sowie die Trennung der gesamten EV-Population auf der Grundlage der Dichte zu einer effektiven EVs von Virions zu isolieren.

Protocol

1. Filtration und Niederschlag von extrazellulären Vesikeln (EVs) Um den Kulturüberstand aus infizierten oder transfizierten Zellen (d. h. Zelllinien und/oder Primärzellen) vorzubereiten, kulturieren Sie etwa 10 ml Late-Log-Zellen für 5 Tage bei 37 °C und 5 %CO2 in geeigneten Kulturmedien (d. h. RPMI oder DMEM mit 10 % fetalem Rinder Serum [FBS]).HINWEIS: Alle Kulturmedium-Reagenzien sollten frei von Elektrofahrzeugen sein und können entweder gekauft werden (siehe M…

Representative Results

PEG-Niederschlag erhöht EV-AusbeuteUnser Kombinationsansatz zur EV-Isolierung ist in Bezug auf die EV-Rückgewinnung deutlich effizienter als bei der herkömmlichen Ultrazentrifugation, wie die 90%ige Reduzierung des benötigten Ausgangsmaterials zeigt. Ultrazentrifugation, der aktuelle Goldstandard in der EV-Isolierung, benötigt ca. 100 ml Kulturüberstand, um eine adäquate EV-Vorbereitung für nachgeschaltete Assays zu erzeugen, während unser neuartiges Protokol…

Discussion

Die skizzierte Methode ermöglicht eine verbesserte EEV-Ausbeute und die Trennung von Viren von Elektrofahrzeugen mit einem Kombinationsansatz zur Isolierung. Relativ große Mengen an Ausgangsmaterial (d. h. Zellüberstand) können vor der EV-Isolierung durch Niederschlag, DG-Trennung und Nanopartikelanreicherung gefiltert werden, was zu einem Endvolumen von 30 nachgeschaltete Assays. Die Verwendung der Nanopartikelanreicherung ist unerlässlich, da diese EV-anreichernden Nanopartikel im Vergleich zur herkömmlichen Ultr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten uns bei allen Mitgliedern des Kashanchi-Labors bedanken, insbesondere bei Gwen Cox. Diese Arbeit wurde von national Institutes of Health (NIH) Grants (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894 und NS099029 an F.K.) unterstützt.

Materials

CEM CD4+ Cells NIH AIDS Reagent Program 117 CEM
DPBS without Ca and Mg (1X) Quality Biological 114-057-101
ExoMAX Opti-Enhancer Systems Biosciences EXOMAX24A-1 PEG precipitation reagent
Exosome-Depleted FBS Thermo Fisher Scientific A2720801
Fetal Bovine Serum Peak Serum PS-FB3 Serum
HIV-1 infected U937 Cells NIH AIDS Reagent Program 165 U1
Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA Thermo Scientific 723-2520
Nanotrap (NT80) Ceres Nanosciences CN1030 Reactive Red 120 core
Nanotrap (NT82) Ceres Nanosciences CN2010 Cibacron Blue F3GA core
Optima XE-980 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma-Aldrich D1556-250mL Iodixanol
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter 331362
Ultra-Clear Tube, 14x89mm Beckman Coulter 344059

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DeMarino, C., Barclay, R. A., Pleet, M. L., Pinto, D. O., Branscome, H., Paul, S., Lepene, B., El-Hage, N., Kashanchi, F. Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus. J. Vis. Exp. (151), e59876, doi:10.3791/59876 (2019).

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