Очистка высокой урожайности Внеклеточных Препаратов Весикл вдали от вируса

Исследования вокруг внеклеточных пузырьков (EVs), в частности экзосомы, тип EV в диапазоне 30-120 нм и характеризуется наличием трех тетраспанина маркеров CD81, CD9, и CD63, в значительной степени формируется в результате разработки методов изолировать и очистить пузырьки интереса. Способность вскрывать многогранные механизмы была затруднена из-за сложных и трудоемких методов, которые генерируют образцы, состоящие из разнородной популяции пузырьков, генерируемых различными путями с широким диапазоном содержимого, размеров и Плотности. Хотя это вопрос для почти всех исследований EV, это особенно важно при изучении EVs в контексте вирусной инфекции, как virions и вирусоподобных частиц (VLPs) может быть похож по диаметру на пузырьки интереса. Например, вирус иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) составляет около 100 нм в диаметре, что примерно такого же размера, как и многие типы Экв. По этой причине мы разработали новый рабочий процесс изоляции EV для решения этих вопросов.

Текущий золотой стандарт изоляции EV является ультрацентрифугированием. Этот метод использует различные злодеи везикулы, что позволяет пузырьков быть разделены центрифугации с дифференциальной осаждения частиц более высокой плотности по сравнению с частицами более низкой плотности на каждом этапе ^1,2. Для удаления нетронутых клеток (300-400 х г на 10 мин), клеточного мусора (2000 х г на 10 мин) требуется несколько низкоскоростных шагов/крупных пузырьков (10 000 х г на 10 мин). Эти первоначальные очищения следуют высокоскоростной ультрацентрифугирования (100000-20000 х г для 1,5-2 ч) для отложений ЭВ. Стирки выполняются для дальнейшего обеспечения чистоты EV, однако, это приводит к сокращению числа изолированных EVs, тем самым снижая общую доходность ^3,4. Полезность этого метода еще больше ограничена потребностью в большом количестве ячеек (примерно 1 х 10⁸⁾и большом объеме выборки (Зтт; 100 мл) для достижения адекватных результатов.

Для решения растущих проблем, осадки пузырьков с гидрофильных полимеров стало полезным методом в последние годы. Полиэтиленгликоль (PEG), или другие связанные с ними реагенты осадков, позволяет пользователю снести пузырьки, вирусы и белковые или белковые РНК агрегаты в образце, просто инкубируя образец с реагентом выбора, а затем один низкоскоростной центрифугация^1,2,5. Мы ранее сообщали, что использование PEG или связанных с ними методов для осаждения EVs по сравнению с традиционными ультрацентрифугация приводит к значительно более высокой урожайности⁶. Эта стратегия быстрая, легкая, не требует дополнительного дорогостоящего оборудования, легко масштабируема и сохраняет структуру EV. Однако, из-за беспорядочной природы этого метода, полученные образцы содержат разнообразие продуктов включая свободные протеины, комплексы протеина, ряд EVs, и virions таким образом требуя более дальнеишее очищение для того чтобы получить пожеланное населенность^{1 ,2,7,8}.

Для преодоления неоднородности ЭВ, полученных из различных методов осадков, градиент плотности ультрацентрифугирования (DG) используется для лучшего разделения частиц на основе их плотности. Этот метод осуществляется с использованием поэтапного градиента с использованием градиентной среды плотности, такой как йодиксанол или сахароза, что позволяет отделять ЭВ от белков, белковых комплексов и вирусоподобных частиц (VLPs). Важно отметить, что, хотя когда-то считалось, что ГД допускает более точное разделение субпопуляций Ev, в настоящее время известно, что размеры и плотность различных пузырьков могут перекрываться. Например, экзосомы, как известно, имеют плотность флотации 1,08-1,22 г/мл⁹, в то время как везикулы, изолированные от Голги (COPI или clathrin⁾имеют плотность 1,05-1,12 г/мл и те из эндоплазмического ретикулума (COPII) ) осадки на 1.18-1.25 г/мл^1,2,3,4,9. Кроме того, если желать сравнить экзосомальные фракции с фракциями, содержащими вирусные частицы, это может стать более трудным в зависимости от плотности вируса, интересующего, есть вирусы, кроме ВИЧ-1, которые, вероятно, уравновешивают сятко плотности как экзосомальные положительные фракции².

Наконец, обогащение EV preps для визуализации вниз по течению и функциональных анализов имеет жизненно важное значение для исследований EV. Использование наночастиц, обогащающих EV, в частности многофункциональных частиц гидрогеля диаметром 700-800 нм, является важным шагом в достижении концентрированных препон EV. Они обладают высоким сродством ароматические приманки, которые инкапсулированы пористой внешней оболочки сито для содействия избирательности. Наночастицы, используемые в этом исследовании включают в себя два различных препаратов с различными приманками ядра (Реактивный красный 120 NT80; и Cibacron Blue F3GA NT82), которые показали, что увеличение захвата EVs из различных реагентов и биожидкости (см. таблицу материалов )^{6,10,11,12,13,14,15}. Частицы предлагают легкое обогащение EVs из многочисленных исходных материалов, включая фракции йодиксанола, супернатант клеточной культуры, а также биожидкости пациента, такие как плазма, сыворотка, спинномозговая жидкость (CSF), и моча^6,13 .

Представленный здесь метод повышает эффективность современных методов очистки EV, объединяя несколько технологий; EV осадков, градиент аттестации плотности ультрацентрифугирования, и улавливания частиц, чтобы упорядочить рабочий процесс, уменьшить требования к выборке, и увеличить урожайность для получения более однородной образец EV для использования во всех исследованиях EV. Этот метод особенно полезен в исследовании EVs и их содержание во время вирусной инфекции, как она включает в себя 0,22 мкм фильтрации шаг, чтобы исключить большие, нежелательные пузырьки и VLPs и разделение общей популяции EV на основе плотности эффективно изолировать EVs от virions.