Identificación de fosfato de inositol o proteínas que interactúan con fosfoinositida por cromatografía de afinidad acoplada a Western Blot o espectrometría de masas

Los fosfatos de inositol (IPs) y los fosfoinositidos (PI) desempeñan un papel central en la biologíadel eucariota a través de la regulación de los procesos celulares como el control de la expresión génica 1,^2,3, tráfico de vesículas ⁴, transducción de señal^5,6, metabolismo^7,8,9, y desarrollo^8,10. La función reguladora de estos metabolitos resulta de su capacidad para interactuar con las proteínas y así regular la función proteica. Tras la unión por proteínas, las IPs y los INDICADORes de usuario pueden alterar la conformación de proteínas^11,la actividad catalítica¹²o las interacciones¹³ y, por lo tanto, afectar la función celular. Las IPs y pIs se distribuyen en múltiples compartimentos subcelulares, tales como núcleo^2,3,14,15, retículo endoplasmático^16,17, plasma membrana¹ y citosol^18,ya sea asociadas a proteínas^3,19 o con ARN^20.

El escote de la membrana asociada a PI(4,5)P2 por fosfolipasa C da como resultado la liberación de Ins(1,4,5)P3, que puede ser fosforilado o desfosforilado por quinasas IP y fosfatasas, respectivamente. Las IPs son moléculas solubles que pueden unirse a las proteínas y ejercer funciones reguladoras. Por ejemplo, Ins(1,4,5)P3 en metazoan puede actuar como un segundo mensajero mediante la unión a los receptores IP3, que induce los cambios de conformación de receptores y por lo tanto la liberación de Ca^{2 +} de los almacenes intracelulares¹¹. Ins(1,3,4,5)P4 se une al complejo histona deacetilasa y regula el ensamblaje y la actividad del complejo proteico¹³. Otros ejemplos de la función reguladora de IPs incluyen el control de la organización de la cromatina²¹, el transporte de ARN^22,23, la edición de ARN²⁴y la transcripción^1,2,3 . Por el contrario, los indicadores de calidad a menudo se asocian con el reclutamiento de proteínas en la membrana plasmática u membranas orgánulos^25. Sin embargo, una propiedad emergente de los PE es la capacidad deasociarse con proteínas en un entorno no membranoso 3,^15,19,26. Este es el caso del factor esteroideogénico del receptor nuclear, que la función de control transcripcional está regulada por PI(3,4,5)P3¹⁹, y poli-A polimerasa que la actividad enzimática está regulada por PI nuclear(4,5)P2²⁶. Se ha demostrado un papel regulador para las IPs y los INDICADORes de poder en muchos organismos, entre ellos la levadura^22,27, las células de mamíferos^19,23, Drosophila¹⁰ y los gusanos^28. De importancia es el papel de estos metabolitos en los tripanosomas, que divergieron temprano del linaje eucariota. Estos metabolitos desempeñan un papel esencial en el control transcripcional de Trypanosoma brucei ^1,3, desarrollo⁸, biogénesis de organélteme y tráfico proteico^{29,30 , 31 , 32}, y también participan en el control del desarrollo y la infección en los patógenos T. cruzi^33,34,35,Toxoplasma³⁶ y Plasmodium ^{5 , 37}. Por lo tanto, comprender el papel de las iP y los indicadores de rendimiento en los tripanosomas puede ayudar a dilucidar una nueva función biológica para estas moléculas e identificar nuevos objetivos farmacológicos.

La especificidad de la proteína y la unión IP o PI depende de los dominios de interacción de proteínas y el estado de fosforilación del inositol^13,38, aunque las interacciones con la parte lipídica de los indicadores de rendimiento también se producen¹⁹. La variedad de IPs y PIs y sus quinasas modificadoras y fosfaplanas proporciona un mecanismo celular flexible para controlar la función proteica que está influenciado por la disponibilidad y abundancia de metabolitos, el estado de fosforilación del inositol, y la proteína afinidad de interacción^1,3,13,38. Aunque algunos dominios proteicos están bien caracterizados^39,40,41, por ejemplo, dominio de homología de pleckstrina⁴² y SPX (SYG1/Pho81/XPR1) dominios^{43 ,44,45}, algunas proteínas interactúan con IPs o PIs por mecanismos que permanecen desconocidos. Por ejemplo, la proteína represor-activadora 1 (RAP1) de T. brucei carece de dominios canónicos de unión PI, pero interactúa con PI(3,4,5)P3 y controla la transcripción de genes implicados en la variación antigénica³. Cromatografía de afinidad y análisis de espectrometría de masas de proteínas de interacción IP o PI a partir de células tripanosomasas, de levadura o de mamíferos identificados varias proteínas sin dominios conocidos de unión IP o PI^{8,46, 47}. Los datos sugieren dominios proteicos adicionales no caracterizados que se unen a estos metabolitos. Por lo tanto, la identificación de proteínas que interactúan con IPs o PIs puede revelar nuevos mecanismos de interacción proteína-metabolito y nuevas funciones reguladoras celulares para estas moléculas pequeñas.

El método descrito aquí emplea cromatografía de afinidad acoplada a la hincha occidental o espectrometría de masas para identificar proteínas que se unen a iPs o PIs. Utiliza IP biotiniadas o PIs que están reticuladas a estreptavidina conjugadas con cuentas de agarosa o, alternativamente, capturadas a través de cuentas magnéticas conjugadas con estreptavidina (Figura1). El método proporciona un flujo de trabajo simple que es sensible, no radioactivo, libre de liposomas y es adecuado para detectar la unión de proteínas de los lysatos celulares o proteínas purificadas³ (Figura 2). El método se puede utilizaren proteínas de masa cuantitativa 47 sin etiquetas 8,⁴⁶ o acopladas a espectrometría cuantitativa de masas con etiqueta de aminoácidos⁴⁷ para identificar proteínas IP o PI-binding a partir de muestras biológicas complejas. Por lo tanto, este método es una alternativa a los pocos métodos disponibles para estudiar la interacción de IPs o PI con proteínas celulares y ayudará a entender la función reguladora de estos metabolitos en los tripanosomas y tal vez otros eucariotas.