Identificação de fosfato de inositol ou proteínas Fosfoinositídeo interagindo por cromatografia de afinidade acoplada a Western blot ou espectrometria de massas

Fosfatos de inositol (IPS) e fosfoinositídeos (PIS) desempenham um papel central na biologia eucariote através da regulação de processos celulares como o controle da expressão gênica^1,2,3, tráfico de vesículas ⁴, transdução de sinal^5,6, metabolismo^7,8,9e desenvolvimento^8,10. A função reguladora destes metabolitos resulta da sua capacidade de interagir com proteínas e, assim, regular a função proteica. Após a ligação por proteínas, IPs e PIs podem alterar a conformação de proteínas¹¹, atividade catalítica¹², ou interações¹³ e, portanto, afetam a função celular. IPS e PIS são distribuídos em múltiplos compartimentos subcelulares, como o núcleo^2,3,14,15, retículo endoplasmático^16,17, plasma membrana¹ e citosol¹⁸, ambas associadas com proteínas^3,19 ou com RNAs²⁰.

A clivagem do PI associado à membrana (4, 5) P2 pela fosfolipase C resulta na liberação de ins (1, 4, 5) P3, que podem ser fosforilados ou deposforilados por IP quinases e fosfatases, respectivamente. IPs são moléculas solúveis que podem se vincular a proteínas e exercer funções regulatórias. Por exemplo, ins (1, 4, 5) P3 no metazoano podem atuar como um segundo mensageiro ligando-se aos receptores IP3, o que induz alterações conformacionais do receptor e, assim, liberação de CA^{2 +} de lojas intracelulares¹¹. Ins (1, 3, 4, 5) P4 liga-se ao complexo histona deacetilase e regula o conjunto complexo proteico e a atividade¹³. Outros exemplos de função regulatória de IPS incluem o controle da organização decromatina²¹, transporte de RNA^22,23, edição de RNA²⁴e transcrição^1,2,3 . Em contrapartida, os pis estão frequentemente associados ao recrutamento de proteínas para a membrana plasmática ou membranas Organela²⁵. No entanto, uma propriedade emergente do PIS é a capacidade de associar-se a proteínas em um ambiente não membranoso^3,15,19,26. Este é o caso do fator esteroidogênicas do receptor nuclear, que a função de controle transcricional é regulada pelo PI (3, 4, 5) P3¹⁹, e pela polimerase poli-A que a atividade enzimática é regulada pelo PI nuclear (4, 5) P2²⁶. Um papel regulatório para IPS e PIS foi demonstrado em muitos organismos, incluindo^{levedura 22,27}, células de^{mamíferos 19,23}, Drosophila¹⁰ e worms²⁸. De significância é o papel desses metabólitos em tripanossomas, que divergiram precocemente da linhagem eucariótica. Estes metabolitos desempenham um papel essencial no controlo transcripcional de Trypanosoma brucei ^1,3, desenvolvimento⁸, biogênese organela e tráfego proteico^{29,30 , 31 de dezembro , 32}, e também estão envolvidos no controle do desenvolvimento e infecção nos patógenos T. cruzi^33,34,35, Toxoplasma³⁶ e Plasmodium ^{5. º , 37}. portanto, compreender o papel dos IPS e PIS em tripanossomas pode ajudar a elucidar a nova função biológica para essas moléculas e identificar novos alvos de drogas.

A especificidade da ligação proteína e IP ou PI depende dos domínios de interação protéica e do estado de fosforilação do inositol^13,38, embora as interações com a parte lipídica do PIS também ocorra¹⁹. A variedade de IPs e PIs e suas cinases modificadoras e fosfatases fornece um mecanismo celular flexível para controlar a função protéica que é influenciada pela disponibilidade e abundância do metabolito, o estado de fosforilação do inositol e proteínas afinidade da interação^1,3,13,38. Embora alguns domínios proteicos sejam bem caracterizados^39,40,41, por exemplo, domínio de homologia de homologia⁴² e SPX (SYG1/Pho81/XPR1) domínios^{43 ,44,45}, algumas proteínas interagem com IPS ou PIS por mecanismos que permanecem desconhecidos. Por exemplo, a proteína 1 (RAP1) do repressor-ativador de T. brucei carece de domínios de vinculação de PI canônicos, mas interage com pi (3, 4, 5) P3 e controle de transcrição de genes envolvidos na variação antigênica³. A cromatografia de afinidade e a análise de espectrometria de massas de proteínas IP ou PI que interagem de trypanosome, levedura ou células de mamíferos identificaram várias proteínas sem domínios de ligação IP ou PI conhecidos^{8,46, 47}. os dados sugerem domínios proteicos não caracterizados adicionais que se ligam a estes metabolitos. Assim, a identificação de proteínas que interagem com IPs ou PIs pode revelar novos mecanismos de interação proteína-metabólito e novas funções reguladoras celulares para essas pequenas moléculas.

O método descrito aqui emprega a cromatografia de afinidade acoplada à mancha ocidental ou à espectrometria maciça para identificar as proteínas que ligam ao IPs ou ao PIs. Utiliza IPs biotinilados ou PIs que estão ligados a streptavidina conjugados a grânulos de agarose ou, alternativamente, capturados através de grânulos magnéticos conjugados com streptavidina (Figura 1). O método fornece um fluxo de trabalho simples que é sensível, não radioativo, Liposome-livre e é adequado para detectar a ligação de proteínas de lisados celulares ou proteínas purificadas³ (Figura 2). O método pode ser usado em Label-Free^8,46 ou acoplado a espectrometria de massas quantitativa com rótulo de aminoácido⁴⁷ para identificar proteínas de ligação IP ou PI de amostras biológicas complexas. Assim, este método é uma alternativa aos poucos métodos disponíveis para estudar a interação de IPs ou PIs com proteínas celulares e ajudará na compreensão da função regulatória desses metabólitos em tripanossomas e talvez outros eucariontes.