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Biochemistry

アフィニティクロマトグラフィーによるインノシトールリン酸塩またはホスホイノシチド相互作用タンパク質の同定

Published: July 26, 2019
doi:
10.3791/59865
1Institute of Parasitology,McGill University

Summary

このプロトコルは、イノシトールリン酸塩またはホスホイノシチドに結合するタンパク質の同定に焦点を当てています。これは、アガロースまたは磁気ビーズにストレプトアビジンを介して固定化されたバイオチン化イノシトールリン酸塩またはリンオイノシチドとの親和性クロマトグラフィーを使用しています。イノシトールリン酸塩またはホスオイノシチド結合タンパク質は、ウェスタンブロッティングまたは質量分析によって同定される。

Abstract

イノシトールリン酸塩およびホスホイノシチドは、遺伝子発現、小胞の人身売買、シグナル伝達、代謝、および発達を含む真核生物のいくつかの細胞プロセスを調節する。これらの代謝産物は、タンパク質に結合することによってこの調節活性を実行し、それによってタンパク質の立体構造、触媒活性、および/または相互作用を変化させる。ここで説明する方法は、質量分析またはウェスタンブロッティングに結合されたアフィニティクロマトグラフィーを使用して、イノシトールリン酸塩またはホスホイノシチドと相互作用するタンパク質を同定する。イノシトールリン酸塩またはホスホイノシチドは、化学的にビオチンでタグ付けされ、その後、アガロースまたは磁気ビーズに結合したストレプトアビジンを介して捕捉される。タンパク質は、代謝物との結合の親和性によって単離され、次いで、質量分析またはウェスタンブロッティングによってタンパク化され、同定される。この方法は、感度が高く、非放射性、リポソームフリー、カスタマイズ可能なシンプルなワークフローを備えており、タンパク質と代謝産物の相互作用を精度で解析できます。このアプローチは、ラベルフリーまたはアミノ酸標識定量質量分析法で、複雑な生物学的試料中のタンパク質代謝産物相互作用を同定したり、精製されたタンパク質を使用したりするために使用できます。このプロトコルは、トリパノソマブルーサイからのタンパク質の分析のために最適化されていますが、関連する原虫寄生虫、酵母または哺乳動物細胞に適応することができます。

Introduction

イノシトールリン酸塩(IP)とホスホイノシチド(POI)は、遺伝子発現1、2、3、小胞の人身売買などの細胞プロセスの調節を通じて、白質生物生物学において中心的な役割を果たしている。4、信号伝達5、6、代謝7、8、9、および発達8、10。これらの代謝産物の調節機能は、タンパク質と相互作用し、したがってタンパク質機能を調節する能力から生じます.タンパク質によって結合すると、IPおよびピは、タンパク質立体構造11、触媒活性12、または相互作用13を変化させ、したがって細胞機能に影響を与える。IPおよびPは、核2、3、14、15、小平性網膜16、17、プラズマなどの複数の細胞下コンパートメントに分布している。膜1およびサイトゾル18は、タンパク質3、19またはRNA20に関連する。

ホスホリパーゼCによる膜関連PI(4,5)P2の切断は、それぞれIPキナーゼおよびホスファターゼによってリン酸化または脱リン酸化されうるIns(1,4,5)P3の放出をもたらす。IPは、タンパク質に結合し、調節機能を発揮することができる可溶性分子です。例えば、メタゾンにおけるIns(1,4,5)P3は、IP3受容体に結合することによって第2のメッセンジャーとして作用することができ、これは受容体立体構造変化を誘導し、したがって細胞内ストア11からCa2+の放出を誘導する。Ins(1,3,4,5)P4はヒストンデアセチラーゼ複合体に結合し、タンパク質複合体の組み立ておよび活性13を調節する。IP調節機能の他の例は、クロマチン組織21、RNA輸送22、23、RNA編集24、および転写1、2、3の制御を含む.対照的に、ピニは、多くの場合、血漿膜またはオルガネラ膜25へのタンパク質の募集に関連する。しかし、新しいPの特性は、非membranous環境3、15、19、26のタンパク質と関連付ける能力である。これは、転写制御機能がPI(3,4,5)P319によって調節される核受容体ステロイド生成因子の場合であり、および酵素活性が核PI(4,5)P226によって調節されるポリAポリメラーゼである。IPおよびPIの調節的役割は、酵母22、27、哺乳動物細胞19、23、ショウジョウバエ10およびワーム28を含む多くの生物で示されている。重要なのは、真核系統から早期に発散したトリパノソームにおけるこれらの代謝産物の役割である。これらの代謝産物は、トリパノソマブルーサイ転写制御1、3、開発8、器官生体形成およびタンパク質トラフィック29、30において重要な役割を果たす,31歳,32、および病原体T.クルジ33、34、35、トキソプラズマ36およびプラスモジウムにおける発達および感染の制御にも関与している5,37.したがって、トリパノソームにおけるIPとPIの役割を理解することは、これらの分子の新しい生物学的機能を解明し、新しい薬物標的を同定するのに役立つ可能性がある。

タンパク質およびIPまたはPI結合の特異性は、イノシトール13、38のタンパク質相互作用ドメインおよびリン酸化状態に依存するが、PIの脂質部分との相互作用も19である。様々なIプとピと、その修飾キナーゼおよびホスファターゼは、代謝産物の利用可能性と豊富さ、イノシトールのリン酸化状態、およびタンパク質の影響を受けるタンパク質機能を制御するための柔軟な細胞機構を提供します。相互作用の親和性1,3,13,38.一部のタンパク質ドメインは39、40、41、例えば、プレクストリン相同性ドメイン42およびSPX(S YG1/P ho81/XPR1)ドメイン43を特徴とするが ,44,45, 一部のタンパク質は、未知のままであるメカニズムによって、IPまたはPと相互作用する。例えば、T.bruceiのリプレッサ活性化タンパク質1(RAP1)は、正規のPI結合ドメインを欠いているが、PI(3,4,5)P3と相互作用し、抗原変動3に関与する遺伝子の転写を制御する。トリパノソーム、酵母、または哺乳動物細胞からのIPまたはPI相互作用タンパク質の親和性クロマトグラフィーおよび質量分析分析は、既知のIP-またはPI結合ドメインなしでいくつかのタンパク質を同定した8、46、47.データは、これらの代謝産物に結合する追加の無特徴タンパク質ドメインを示唆している。したがって、IPやピと相互作用するタンパク質の同定は、これらの低分子に対するタンパク質代謝物相互作用と新しい細胞調節機能の新しいメカニズムを明らかにする可能性がある。

ここで説明する方法は、ウェスタンブロッティングまたは質量分析に結合したアフィニティクロマトグラフィーを採用し、IPまたはPIに結合するタンパク質を同定する。これは、アガロースビーズに結合したストレプトアビジンに架橋されるか、または代わりに、ストレプトアビジン結合磁気ビーズを介して捕捉されたバイオミチル化されたIPまたはピを使用します(図1)。この方法は、感受性、非放射性、リポソームフリーであり、細胞のリザエートまたは精製タンパク質3からのタンパク質の結合を検出するのに適した簡単なワークフローを提供する(図2)。この方法は、標識のない8、46、またはアミノ酸標識定量質量分析47に結合して、複雑な生物学的試料からIPまたはPI結合タンパク質を同定するために使用することができる。したがって、この方法は、細胞タンパク質とのIPまたはピの相互作用を研究するために利用可能ないくつかの方法に代わるものであり、トリパノソームおよびおそらく他の真核生物におけるこれらの代謝産物の調節機能を理解するのに役立ちます。

Protocol

1. 親和性クロマトグラフィーとウェスタンブロッティングによるIP結合タンパク質の解析 細胞増殖、リシスおよび親和性クロマトグラフィー T.ブルーシー細胞を中間ログ相に成長させ、細胞の生存率と密度を監視します。1つの結合アッセイには合計5.0 x 107細胞で十分です。 血流形態の場合、37°Cおよび5%CO2で10%の胎児ウシ血清(FBS)を補充したHMI-…

Representative Results

親和性クロマトグラフィーとウェスタンブロッティングによるRAP1とPI(3,4,5)P3相互作用の解析この例は、この方法を用いて、T.ブルシー・リサートまたは組換えT.ブルーシーRAP1タンパク質からのRAP1による結合を分析する。ヘマグルチニン(HA)タグ付きRAP1を発現するT.ブルーセイ血流形態のライサテスを結合アッセイに用いた。RAP1は、変異面糖タンパク質(VSG)遺…

Discussion

これらの代謝産物の細胞機能を理解するためには、IPまたはPに結合するタンパク質の同定が重要です。ウェスタンブロットまたは質量分析に結合されたアフィニティクロマトグラフィーは、IPまたはPI相互作用タンパク質を同定し、その調節機能に関する洞察を得る機会を提供します。IPまたはPは化学的にタグ付けされた[例えば、Ins(1,4,5)P3はビオチンに化学的にリンクされている]とストレプ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、カナダの自然科学工学研究評議会(NSERC、RGPIN-2019-04658)によって支援されました。NSERCディスカバリーは、初期のキャリア研究者のためのサプリメントを起動します (DGECR-2019-00081) とマギル大学.

Materials

Acetone Sigma-Aldrich 650501 Ketone
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004 Solvent 
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich A6141 Inorganic salt
Centrifuge Avanti J6-MI Beckman Coulter Avanti J6-MI Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)
Centrifuge botles Sigma-Aldrich B1408 Bottles for centrifugation of 1L of culture
Control Beads Echelon P-B000-1ml Affinity chromatography reagent – control
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Sugar, Added in PBS to keep cells viable
Dithiothreitol (DTT)  Bio-Rad 1610610 Reducing agent
Dynabeads M-270 Streptavidin ThermoFisher Scientific 65305 Streptavidin beads for binding to biotin ligands
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001 Protease inhibitors
Electrophoresis running buffer Bio-Rad 1610732 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning Life Sciences 430052 To centrifuge 10 mL cultures
Formic acid Sigma-Aldrich 106526 Acid
Glycine Sigma-Aldrich G7126 Amino acid
HMI-9 cell culture medium ThermoFisher Scientific ME110145P1 Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms
Imperial Protein Stain ThermoFisher Scientific 24615 Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 Beads Echelon Q-B0145-1ml Affinity chromatography reagent 
Instant Nonfat Dry Milk Thomas Scientific C837M64 Blocking reagent for Western blotting
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125 Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides
Lab Rotator Thomas Scientific 1159Z92 For binding assays
LoBind Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 13-698-793 Low protein binding tubes for mass spectrometry
Nonidet P-40 (Igepal CA-630) Sigma-Aldrich 21-3277 Detergent
PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010031 Physiological buffer
Peroxidase substrate for chemiluminescence ThermoFisher Scientific 32106 Substrate for Western bloting detection of proteins
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche 4906845001 Phosphatase inhibitors
PI(3)P PIP Beads Echelon P-B003a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4)P2 PIP Beads Echelon P-B034a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 diC8 Echelon P-3908-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 PIP Beads Echelon P-B345a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,5)P2 PIP Beads Echelon P-B035a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4)P PIP Beads Echelon P-B004a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 diC8 Echelon P-4508-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 PIP Beads Echelon P-B045a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(5)P PIP Beads Echelon P-B005a-1ml Affinity chromatography reagent 
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170 Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)
Potassium hexacyanoferrate(III) Sigma-Aldrich 702587 Potassium salt 
PtdIns PIP Beads Echelon P-B001-1ml Affinity chromatography reagent 
PVDF Membrane Bio-Rad 1620177 For Western blotting 
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5910 R Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 862010 Detergent
Sodium thiosulfate Sigma-Aldrich 72049 Chemical 
SpeedVac Vacuum Concentrators ThermoFisher Scientific SPD120-115 Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)
T175 flasks for cell culture  ThermoFisher Scientific 159910 To grow 50 mL T. brucei culture
Trypsin, Mass Spectrometry Grade Promega V5280 Trypsin for protein digestion
Urea Sigma-Aldrich U5128 Denaturing reagent
Vortex Fisher Scientific 02-215-418 For mixing reactions
Western blotting transfer buffer Bio-Rad 1610734 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol
Whatman 3 mm paper Sigma-Aldrich WHA3030861 Paper for Wester transfer
2-mercaptoethanol (14.2 M) Bio-Rad 1610710 Reducing agent
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Protein loading buffer
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 4561094 Gel for protein electrophoresis
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Protein loading buffer
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Inositol PhosphatePhosphoinositideProtein BindingAffinity ChromatographyWestern BlotMass SpectrometryRegulatory FunctionSignal TransductionCell DevelopmentBiotinylatedLyposome FreeT. BruceiPBS-GLysis BufferProtease InhibitorPhosphatase InhibitorBinding Assay

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Cestari, I. Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (149), e59865, doi:10.3791/59865 (2019).
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