JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

זיהוי של אינוזיטול פוספט או זרחן אינטראקציה חלבונים על-ידי כרומטוגרפיה של אהדה מצמידים לאבן חשופה מערבית או ספקטרומטר המסה

Published: July 26, 2019
doi:
10.3791/59865
1Institute of Parasitology,McGill University

Summary

פרוטוקול זה מתמקד בזיהוי של חלבונים התאגד כדי אינוזיטול פוספטים או פוספופנוסיידים. היא משתמשת בכרומטוזיקה באמצעות מלחי הביוטיטול או פוספופנוסידים הנמצאים בדרך streptavidin לחרוזים או חרוזי מגנטים. אינוזיטול פוספט או פוספוליזיסיטייז מחייב חלבונים מזוהים על ידי בלוק מערבי או ספקטרומטריה מאסיבית.

Abstract

מלחי אינוזיטול ופוספוליזידים מווסת מספר תהליכים סלולריים ב-eukaryotes, כולל ביטוי גנטי, סחר בסמים, התמרה של אותות, חילוף חומרים, ופיתוח. מטבוליטים אלה לבצע פעילות תקינה זו על ידי איגוד לחלבונים, ובכך שינוי היווצרות חלבון, פעילות קטליטי, ו/או אינטראקציות. השיטה המתוארת כאן משתמשת בכרומטוגרפיה של זיקה בשילוב עם הספקטרומטר המסה או הכתמים המערביים כדי לזהות חלבונים הפועלים באינטראקציה עם מלחי אינוזיטול או פוספופנוסיידים. הפוספטים inositol או פוספיונוסיידים הם כימית מתויג עם biotin, אשר נלכד אז באמצעות streptavidin מצועם מעלה או חרוזים מגנטיים. חלבונים מבודדים על ידי הזיקה שלהם של קשירה המטולוליט, ולאחר מכן הודללו וזוהו על ידי ספקטרומטר המסה או בלוק המערבי. השיטה יש זרימת עבודה פשוטה רגיש, לא רדיואקטיבי, ליפומי-חינם, להתאמה אישית, תמיכה בניתוח של חלבון ואינטראקציה מטבלייט עם דיוק. גישה זו יכולה לשמש ללא תווית או בחומצה אמינית מתויג כמותית שיטות המסה כדי לזהות אינטראקציות חלבון-מטבוליט בדגימות ביולוגיות מורכבות או באמצעות חלבונים מטוהרים. פרוטוקול זה מותאם במיוחד לניתוח של חלבונים מטריאנוסומה ברוסייבי, אך ניתן להתאים אותו לטפילים פרוטוזוקיים, שמרים או מהיונקים.

Introduction

אינוסיטול פוספטים (IPs) ו פוספהונוסידים (פיס) לשחק תפקיד מרכזי בביולוגיה איקריוטים באמצעות התקנה של תהליכים סלולריים כגון השליטה בביטוי הגנים1,2,3, שלפוחית הסחר 4, שינוי האותות של5,6, מטבוליזם7,8,9, ופיתוח8,10. הפונקציה התקינה של מטבוליטים אלה תוצאות מהיכולת שלהם אינטראקציה עם חלבונים ובכך לווסת את תפקוד החלבון. עם כריכה על ידי חלבונים, IPs ו-פיס עשויים לשנות את היווצרות חלבון11, פעילות קטליטי12, או אינטראקציות13 ומכאן להשפיע על הפונקציה התאית. שב ס ו-פיס מופצים בתאי משנה מרובים, כגון: גרעין2,3,14,15, אנפלזמית ברשת16,17, פלזמה ממברנה1 ו ציטוסול18, המשויכים לחלבונים3,19 או עם rnas20.

המחשוף של הממברנה המשויכת PI (4, 5) P2 ידי פוספוליפדאז C תוצאות בשחרור של Ins (1, 4, 5) P3, אשר יכול להיות זרחנים או deated על ידי הקיסים IP ו פוספאטטיות, בהתאמה. שב ס מולקולות מסיסים שיכולות לאגד חלבונים ולהפעיל פונקציות רגולטוריות. לדוגמה, Ins (1, 4, 5) P3 ב מטזוזה יכול לשמש כשליח השני על ידי מחייב IP3 קולטנים, אשר מעורר שינויים בקולטן ובכך לשחרר של Ca2 + מן חנויות תאיים11. Ins (1, 3, 4, 5) P4 נקשר לקומפלקס הימרחליקלז ומסדיר הרכבה ופעילות של מורכבות חלבון13. דוגמאות אחרות של הפונקציה התקינה של IPs כוללות את השליטה של ארגון כרומטין21, rna תחבורה22,23, RNA עריכה24, ושעתוק1,2,3 . לעומת זאת, הפיס משויך לעתים קרובות לגיוס חלבונים לקרום הפלזמה או לקרומים האורגונל25. עם זאת, המאפיין המתעוררים של פיס הוא היכולת לקשר עם חלבונים בסביבה לא קרומי3,15,19,26. זהו המקרה של הגורם לקולטן גרעינית, אשר פונקציה שליטה ההמרה מוסדר על ידי PI (3, 4, 5) P319, ו-פולי פולימראז אשר פעילות אנזימטית מוסדר על ידי הגרעין PI (4, 5) P226. תפקיד רגולטורי עבור IPs ו-פיס הוצג באורגניזמים רבים כולל שמרים22,27, תאים מוחיים19,23, דרוסוהילה10 ותולעים28. המשמעות היא התפקיד של מטבוליטים אלה בטריאנוזומים, אשר התפצל מוקדם מן השושלת איקריוטית. מטבוליטים אלה לשחק תפקיד חיוני בטריאנוסומה ברוסייס1 בקרת שליטה,3, פיתוח8, ארגונית biogenesis ו חלבון התנועה 29,30 , מיכל בן 31 , 32, והם מעורבים גם פיתוח וזיהום של פתוגנים T. cruzi33,34,35, טוקסופלזמה36 ו פלמודיום מיכל 5 , 37. מכאן, הבנת התפקיד של IPs ו-הפיס בטריאנוזומים עשויים לסייע להבהיר פונקציה ביולוגית חדשה עבור מולקולות אלה ולזהות מטרות של סמים חדשניים.

הספציפיות של חלבון ו-IP או כריכת PI תלוי בתחומים של אינטראקציה חלבונים ואת המצב זירחון של אינוזיטול13,38, למרות אינטראקציות עם החלק השומנים של פיס גם מתרחשת19. מגוון של כתובות ה-Ip ו-פיס ושינוי שלהם מספק מנגנון הסלולר גמיש לשליטה בתפקוד החלבון אשר מושפע על ידי זמינות מטבוליזם ושפע, המצב של זירחון של inositol, וחלבון אהדה של אינטראקציה1,3,13,38. למרות כמה תחומים חלבונים מאופיינים היטב39,40,41, למשל, pleckstrin הומולוגיה תחום42 ו SPX (SYG1/Pho81/XPR1) תחומים43 ,44,45, כמה חלבונים אינטראקציה עם IPs או הפיס על ידי מנגנונים שאינם ידועים. לדוגמה, חלבון activator 1 (RAP1) של T. brucei חסר הקאנוני התחומים מחייב pi אבל אינטראקציה עם pi (3, 4, 5) P3 ושליטה שעתוק של גנים המעורבים וריאציה אנטי הגניים3. כרומטוגרפיה וניתוח הספקטרומטר ההמוני של החלבונים בעלי אינטראקציה של ip או pi מתוך טריאנומין, שמרים או תאי מיונקים זיהו מספר חלבונים ללא מחשבים מבוססי IP או pi-כריכה מסוג8,46, 47. הנתונים מציעים מחשבים נוספים שאינם מאופיינים בחלבון שתאגד לאותם מטבוליטים. מכאן, הזיהוי של חלבונים האינטראקציה עם IPs או הפיס עשוי לחשוף מנגנונים חדשניים של האינטראקציה חלבון-מטבוליט ופונקציות חדשות הרגולציה הסלולר עבור אלה מולקולות קטנות.

השיטה המתוארת כאן מעסיקה כרומטוגרפיה של אהדה בשילוב עם הדגמים המערביים או ספקטרומטר המסה כדי לזהות חלבונים הקושרים ל-IPs או לפיס. הוא משתמש ב-IPs biotinylated או ב-“פיס” המקושרים לstreptavidin בעלי מבטים לחרוזים או לחילופין, שנתפסו באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidin-מצוייביים (איור 1). השיטה מספקת זרימת עבודה פשוטה רגישה, לא רדיואקטיבית, ליפומי-חינם, והיא מתאימה לזיהוי הכריכה של חלבונים מתאי ליטים או חלבונים מטוהרים3 (איור 2). ניתן להשתמש בשיטה ללא תווית8,46 או מצמידים לחומצות אמינו ממותגים בעלי שמות מספרים מבוססי חומצה אמימטריה47 כדי לזהות חלבונים של IP או PI-מחייב מדגימות ביולוגיות מורכבות. מכאן, שיטה זו היא חלופה לכמה שיטות זמין ללמוד את האינטראקציה של IPs או הפיס עם חלבונים סלולריים יסייע להבין את התפקוד הרגולטורי של מטבוליטים אלה בטריאנוזומים ואולי eukaryotes אחרים.

Protocol

1. ניתוח החלבונים של IP או PI-מחייב על ידי כרומטוגרפיה של אהדה ובלוק מערבי צמיחת תאים, לליזה וכרומטוגרפיה של זיקה הגדל תאים T. brucei לשלב באמצע היומן ולפקח על הכדאיות וצפיפות התא. סך של 5.0 x 107 תאים מספיק עבור שיטת מחייב אחת. עבור טפסים במחזור הדם, לגדול תאים בתקשו?…

Representative Results

אנליזה של RAP1 ו-PI (3, 4, 5) P3 אינטראקציה באמצעות כרומטוגרפיה של אהדה ובלוק מערבידוגמה זו ממחישה את היישום של שיטה זו כדי לנתח את הכריכה של RAP1 מ t. brucei ליפוסט או על ידי רקומביננטי t. brucei RAP1 חלבון. ליזוטים של T. brucei מחזור הדם צורות לבטא hemagglutinin (HA)-מתויגים RAP1 שימשו בכריכה assays. RA…

Discussion

הזיהוי של חלבונים התאגד ל-IPs או לפיס הוא קריטי להבנת התפקוד התאי של מטבוליטים אלה. כרומטוגרפיה של אהדה מצמידים לאבן החשופה המערבית או לספקטרומטר מסה מציעה הזדמנות לזהות את החלבונים באינטראקציה של IP או PI ומכאן לקבל תובנות על התפקוד הרגולטורי שלהם. שב ס או פיס כימית מתויג [למשל, Ins (1, 4, 5) P3 כימי…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מדעי הטבע והמועצה לחקר ההנדסה של קנדה (NSERC, RGPIN-2019-04658); השקת NSERC גילוי תוספת עבור חוקרים קריירה מוקדמת (DGECR-2019-00081) ועל ידי אוניברסיטת מקגיל.

Materials

Acetone Sigma-Aldrich 650501 Ketone
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004 Solvent 
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich A6141 Inorganic salt
Centrifuge Avanti J6-MI Beckman Coulter Avanti J6-MI Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)
Centrifuge botles Sigma-Aldrich B1408 Bottles for centrifugation of 1L of culture
Control Beads Echelon P-B000-1ml Affinity chromatography reagent – control
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Sugar, Added in PBS to keep cells viable
Dithiothreitol (DTT)  Bio-Rad 1610610 Reducing agent
Dynabeads M-270 Streptavidin ThermoFisher Scientific 65305 Streptavidin beads for binding to biotin ligands
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001 Protease inhibitors
Electrophoresis running buffer Bio-Rad 1610732 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning Life Sciences 430052 To centrifuge 10 mL cultures
Formic acid Sigma-Aldrich 106526 Acid
Glycine Sigma-Aldrich G7126 Amino acid
HMI-9 cell culture medium ThermoFisher Scientific ME110145P1 Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms
Imperial Protein Stain ThermoFisher Scientific 24615 Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 Beads Echelon Q-B0145-1ml Affinity chromatography reagent 
Instant Nonfat Dry Milk Thomas Scientific C837M64 Blocking reagent for Western blotting
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125 Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides
Lab Rotator Thomas Scientific 1159Z92 For binding assays
LoBind Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 13-698-793 Low protein binding tubes for mass spectrometry
Nonidet P-40 (Igepal CA-630) Sigma-Aldrich 21-3277 Detergent
PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010031 Physiological buffer
Peroxidase substrate for chemiluminescence ThermoFisher Scientific 32106 Substrate for Western bloting detection of proteins
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche 4906845001 Phosphatase inhibitors
PI(3)P PIP Beads Echelon P-B003a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4)P2 PIP Beads Echelon P-B034a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 diC8 Echelon P-3908-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 PIP Beads Echelon P-B345a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,5)P2 PIP Beads Echelon P-B035a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4)P PIP Beads Echelon P-B004a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 diC8 Echelon P-4508-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 PIP Beads Echelon P-B045a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(5)P PIP Beads Echelon P-B005a-1ml Affinity chromatography reagent 
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170 Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)
Potassium hexacyanoferrate(III) Sigma-Aldrich 702587 Potassium salt 
PtdIns PIP Beads Echelon P-B001-1ml Affinity chromatography reagent 
PVDF Membrane Bio-Rad 1620177 For Western blotting 
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5910 R Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 862010 Detergent
Sodium thiosulfate Sigma-Aldrich 72049 Chemical 
SpeedVac Vacuum Concentrators ThermoFisher Scientific SPD120-115 Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)
T175 flasks for cell culture  ThermoFisher Scientific 159910 To grow 50 mL T. brucei culture
Trypsin, Mass Spectrometry Grade Promega V5280 Trypsin for protein digestion
Urea Sigma-Aldrich U5128 Denaturing reagent
Vortex Fisher Scientific 02-215-418 For mixing reactions
Western blotting transfer buffer Bio-Rad 1610734 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol
Whatman 3 mm paper Sigma-Aldrich WHA3030861 Paper for Wester transfer
2-mercaptoethanol (14.2 M) Bio-Rad 1610710 Reducing agent
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Protein loading buffer
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 4561094 Gel for protein electrophoresis
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Protein loading buffer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cestari, I., Stuart, K. Inositol phosphate pathway controls transcription of telomeric expression sites in trypanosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2803-2812 (2015).
  2. Odom, A. R., Stahlberg, A., Wente, S. R., York, J. D. A role for nuclear inositol 1,4,5-trisphosphate kinase in transcriptional control. Science. 287 (5460), 2026-2029 (2000).
  3. Cestari, I., McLeland-Wieser, H., Stuart, K. Nuclear Phosphatidylinositol 5-Phosphatase Is Essential for Allelic Exclusion of Variant Surface Glycoprotein Genes in Trypanosomes. Molecular and Cellular Biology. 39 (3), (2019).
  4. Billcliff, P. G., et al. OCRL1 engages with the F-BAR protein pacsin 2 to promote biogenesis of membrane-trafficking intermediates. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 90-107 (2016).
  5. Brochet, M., et al. Phosphoinositide metabolism links cGMP-dependent protein kinase G to essential Ca(2)(+) signals at key decision points in the life cycle of malaria parasites. PLoS Biology. 12 (3), 1001806 (2014).
  6. Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Saiardi, A. The signaling role of inositol hexakisphosphate kinases (IP6Ks). Advances in Enzyme Regulation. 51 (1), 74-82 (2011).
  7. Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics. Science. 334 (6057), 802-805 (2011).
  8. Cestari, I., Anupama, A., Stuart, K. Inositol polyphosphate multikinase regulation of Trypanosoma brucei life stage development. Molecular Biology of the Cell. 29 (9), 1137-1152 (2018).
  9. Bang, S., et al. AMP-activated protein kinase is physiologically regulated by inositol polyphosphate multikinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 616-620 (2012).
  10. Seeds, A. M., Tsui, M. M., Sunu, C., Spana, E. P., York, J. D. Inositol phosphate kinase 2 is required for imaginal disc development in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15660-15665 (2015).
  11. Hamada, K., Miyatake, H., Terauchi, A., Mikoshiba, K. IP3-mediated gating mechanism of the IP3 receptor revealed by mutagenesis and X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4661-4666 (2017).
  12. Watson, P. J., et al. Insights into the activation mechanism of class I HDAC complexes by inositol phosphates. Nature Communications. 7, 11262 (2016).
  13. Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate. Nature. 481 (7381), 335-340 (2012).
  14. Irvine, R. F. Nuclear lipid signalling. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (5), 349-360 (2003).
  15. Sobol, M., et al. UBF complexes with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in nucleolar organizer regions regardless of ongoing RNA polymerase I activity. Nucleus. 4 (6), 478-486 (2013).
  16. Nascimbeni, A. C., et al. ER-plasma membrane contact sites contribute to autophagosome biogenesis by regulation of local PI3P synthesis. EMBO Journal. 36 (14), 2018-2033 (2017).
  17. Martin, K. L., Smith, T. K. The myo-inositol-1-phosphate synthase gene is essential in Trypanosoma brucei. Biochemical Society Transactions. 33, 983-985 (2005).
  18. Matsu-ura, T., et al. Cytosolic inositol 1,4,5-trisphosphate dynamics during intracellular calcium oscillations in living cells. Journal of Cell Biology. 173 (5), 755-765 (2006).
  19. Blind, R. D., et al. The signaling phospholipid PIP3 creates a new interaction surface on the nuclear receptor SF-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (42), 15054-15059 (2014).
  20. Lin, A., et al. The LINK-A lncRNA interacts with PtdIns(3,4,5)P3 to hyperactivate AKT and confer resistance to AKT inhibitors. Nature Cell Biology. 19 (3), 238-251 (2017).
  21. Steger, D. J., Haswell, E. S., Miller, A. L., Wente, S. R., O’Shea, E. K. Regulation of chromatin remodeling by inositol polyphosphates. Science. 299 (5603), 114-116 (2003).
  22. York, J. D., Odom, A. R., Murphy, R., Ives, E. B., Wente, S. R. A phospholipase C-dependent inositol polyphosphate kinase pathway required for efficient messenger RNA export. Science. 285 (5424), 96-100 (1999).
  23. Adams, R. L., Mason, A. C., Glass, L., Aditi, S. R., Wente, Nup42 and IP6 coordinate Gle1 stimulation of Dbp5/DDX19B for mRNA export in yeast and human cells. Traffic. 18 (12), 776-790 (2017).
  24. Macbeth, M. R., et al. Inositol hexakisphosphate is bound in the ADAR2 core and required for RNA editing. Science. 309 (5740), 1534-1539 (2005).
  25. Dickson, E. J., Hille, B. Understanding phosphoinositides: rare, dynamic, and essential membrane phospholipids. Biochemical Journal. 476 (1), 1-23 (2019).
  26. Mellman, D. L., et al. A PtdIns4,5P2-regulated nuclear poly(A) polymerase controls expression of select mRNAs. Nature. 451 (7181), 1013-1017 (2008).
  27. Lee, Y. S., Mulugu, S., York, J. D., O’Shea, E. K. Regulation of a cyclin-CDK-CDK inhibitor complex by inositol pyrophosphates. Science. 316 (5821), 109-112 (2007).
  28. Nagy, A. I., et al. IP3 signalling regulates exogenous RNAi in Caenorhabditis elegans. EMBO Reports. 16 (3), 341-350 (2015).
  29. Hall, B. S., et al. TbVps34, the trypanosome orthologue of Vps34, is required for Golgi complex segregation. Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27600-27612 (2006).
  30. Rodgers, M. J., Albanesi, J. P., Phillips, M. A. Phosphatidylinositol 4-kinase III-beta is required for Golgi maintenance and cytokinesis in Trypanosoma brucei. Eukaryotic Cell. 6 (7), 1108-1118 (2007).
  31. Gilden, J. K., et al. The role of the PI(3,5)P2 kinase TbFab1 in endo/lysosomal trafficking in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 214, 52-61 (2017).
  32. Demmel, L., et al. The endocytic activity of the flagellar pocket in Trypanosoma brucei is regulated by an adjacent phosphatidylinositol phosphate kinase. Journal of Cell Science. 129 (11), 2285 (2016).
  33. Gimenez, A. M., et al. Phosphatidylinositol kinase activities in Trypanosoma cruzi epimastigotes. Molecular and Biochemical Parasitology. 203 (1-2), 14-24 (2015).
  34. Hashimoto, M., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor regulates replication, differentiation, infectivity and virulence of the parasitic protist Trypanosoma cruzi. Molecular Microbiology. 87 (6), 1133-1150 (2013).
  35. Cestari, I., Haas, P., Moretti, N. S., Schenkman, S., Stuart, K. Chemogenetic Characterization of Inositol Phosphate Metabolic Pathway Reveals Druggable Enzymes for Targeting Kinetoplastid Parasites. Cell Chemical Biology. 23 (5), 608-617 (2016).
  36. Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. Journal of Biological Chemistry. 277 (29), 25870-25876 (2002).
  37. McNamara, C. W., et al. Targeting Plasmodium PI(4)K to eliminate malaria. Nature. 504 (7479), 248-253 (2013).
  38. Tresaugues, L., et al. Structural basis for phosphoinositide substrate recognition, catalysis, and membrane interactions in human inositol polyphosphate 5-phosphatases. Structure. 22 (5), 744-755 (2014).
  39. Varnai, P., et al. Quantifying lipid changes in various membrane compartments using lipid binding protein domains. Cell Calcium. 64, 72-82 (2017).
  40. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Letters. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  41. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains–their role in signalling and membrane trafficking. Current Biology. 11 (21), 882-893 (2001).
  42. Klarlund, J. K., et al. Signaling by phosphoinositide-3,4,5-trisphosphate through proteins containing pleckstrin and Sec7 homology domains. Science. 275 (5308), 1927-1930 (1997).
  43. Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
  44. Gerasimaite, R., et al. Inositol Pyrophosphate Specificity of the SPX-Dependent Polyphosphate Polymerase VTC. ACS Chemical Biology. 12 (3), 648-653 (2017).
  45. Potapenko, E., et al. 5-Diphosphoinositol pentakisphosphate (5-IP7) regulates phosphate release from acidocalcisomes and yeast vacuoles. Journal of Biological Chemistry. 293 (49), 19101-19112 (2018).
  46. Wu, M., Chong, L. S., Perlman, D. H., Resnick, A. C., Fiedler, D. Inositol polyphosphates intersect with signaling and metabolic networks via two distinct mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6757-6765 (2016).
  47. Jungmichel, S., et al. Specificity and commonality of the phosphoinositide-binding proteome analyzed by quantitative mass spectrometry. Cell Reports. 6 (3), 578-591 (2014).
  48. Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137 (1), 99-109 (2009).
  49. Cestari, I., Stuart, K. Transcriptional Regulation of Telomeric Expression Sites and Antigenic Variation in Trypanosomes. Current Genomics. 19 (2), 119-132 (2018).
  50. Clough, T., Thaminy, S., Ragg, S., Aebersold, R., Vitek, O. Statistical protein quantification and significance analysis in label-free LC-MS experiments with complex designs. BMC Bioinformatics. 13, 6 (2012).
  51. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  52. DeGrasse, J. A., Chait, B. T., Field, M. C., Rout, M. P. High-yield isolation and subcellular proteomic characterization of nuclear and subnuclear structures from trypanosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 77-92 (2008).
  53. Opperdoes, F. R. A rapid method for the isolation of intact glycosomes from Trypanosoma brucei by Percoll -gradient centrifugation in a vertical rotor. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (3), 181-186 (1981).
  54. Pereira, N. M., de Souza, W., Machado, R. D., de Castro, F. T. Isolation and properties of flagella of trypanosomatids. The Journal of protozoology. 24 (4), 511-514 (1977).
  55. Subota, I., et al. Proteomic analysis of intact flagella of procyclic Trypanosoma brucei cells identifies novel flagellar proteins with unique sub-localization and dynamics. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (7), 1769-1786 (2014).
  56. Fukuda, M., Kojima, T., Kabayama, H., Mikoshiba, K. Mutation of the pleckstrin homology domain of Bruton’s tyrosine kinase in immunodeficiency impaired inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate binding capacity. Journal of Biological Chemistry. 271 (48), 30303-30306 (1996).
  57. Knodler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. BioTechniques. 38 (6), (2005).
  58. Best, M. D. Global approaches for the elucidation of phosphoinositide-binding proteins. Chemistry and Physics of Lipids. 182, 19-28 (2014).

Tags

Inositol PhosphatePhosphoinositideProtein BindingAffinity ChromatographyWestern BlotMass SpectrometryRegulatory FunctionSignal TransductionCell DevelopmentBiotinylatedLyposome FreeT. BruceiPBS-GLysis BufferProtease InhibitorPhosphatase InhibitorBinding Assay

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cestari, I. Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (149), e59865, doi:10.3791/59865 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image