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Biochemistry

Identifizierung von Inositolphosphat oder Phosphoinositid-Wechselwirkungsproteinen durch Affinitätschromatographie gekoppelt an Western Blot oder Massenspektrometrie

Published: July 26, 2019
doi:
10.3791/59865
1Institute of Parasitology,McGill University

Summary

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Identifizierung von Proteinen, die an Inositolphosphate oder Phosphoinositide binden. Es verwendet Affinitätschromatographie mit biotinylierten Inositolphosphaten oder Phosphoinositiden, die über Streptavidin zu Agarose oder magnetischen Perlen immobilisiert werden. Inositolphosphat oder Phosphoinositid-bindende Proteine werden durch western blotting oder Massenspektrometrie identifiziert.

Abstract

Inositolphosphate und Phosphoinositide regulieren mehrere zelluläre Prozesse in Eukaryoten, einschließlich Genexpression, Vesikelhandel, Signaltransduktion, Stoffwechsel und Entwicklung. Diese Metaboliten führen diese regulatorische Aktivität durch Bindung an Proteine durch und verändern dadurch die Proteinkonformation, die katalytische Aktivität und/oder die Wechselwirkungen. Die hier beschriebene Methode verwendet Affinitätschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie oder Western Blotting, um Proteine zu identifizieren, die mit Inositolphosphaten oder Phosphoinositiden interagieren. Inositolphosphate oder Phosphoinositide werden chemisch mit Biotin markiert, das dann über Streptavidin konjugiert zu Agarose oder magnetischen Perlen gefangen wird. Proteine werden durch ihre Affinität zur Bindung an den Metaboliten isoliert, dann eluiert und durch Massenspektrometrie oder Western Blotting identifiziert. Die Methode verfügt über einen einfachen Workflow, der empfindlich, nicht radioaktiv, liposomenfrei und anpassbar ist und die Analyse der Protein- und Metaboliteninteraktion präzise unterstützt. Dieser Ansatz kann in etikettenfreien oder in aminosäuremarkierten quantitativen Massenspektrometriemethoden verwendet werden, um Protein-Metabolit-Wechselwirkungen in komplexen biologischen Proben oder mit gereinigten Proteinen zu identifizieren. Dieses Protokoll ist für die Analyse von Proteinen aus Trypanosoma bruceioptimiert, kann aber an verwandte protozoische Parasiten, Hefe- oder Säugetierzellen angepasst werden.

Introduction

Inositolphosphate (IPs) und Phosphoinositide (PIs) spielen eine zentrale Rolle in der Eukaryotenbiologie durch die Regulierung zellulärer Prozesse wie die Kontrolle der Genexpression1,2,3, Vesikelhandel 4, Signaltransduktion5,6, Stoffwechsel7,8,9, und Entwicklung8,10. Die regulatorische Funktion dieser Metaboliten ergibt sich aus ihrer Fähigkeit, mit Proteinen zu interagieren und damit die Proteinfunktion zu regulieren. Bei Bindung durch Proteine können IPs und PIs die Proteinkonformation11, die katalytische Aktivität12oder Wechselwirkungen13 verändern und somit die zelluläre Funktion beeinflussen. IPs und PIs sind in mehreren subzellulären Kompartimenten verteilt, wie z. B. Kern2,3,14,15, endoplasmatisches Retikulum16,17, Plasma Membran1 und Cytosol18, entweder verbunden mit Proteinen3,19 oder mit RNAs20.

Die Spaltung des membranassoziierten PI(4,5)P2 durch Phospholipase C führt zur Freisetzung von Ins(1,4,5)P3, das durch IP-Kinäsen bzw. Phosphatasen phosphoryliert oder dephosphoryliert werden kann. IPs sind lösliche Moleküle, die an Proteine binden und regulatorische Funktionen ausüben können. Zum Beispiel kann Ins(1,4,5)P3 in Metazoan als zweiter Botenstoff durch Bindung an IP3-Rezeptoren fungieren, was Rezeptor-Konformationsänderungen induziert und somit Ca2+ aus intrazellulären Speichern freigibt11. Ins(1,3,4,5)P4 bindet an den Histon-Deacetylase-Komplex und reguliert die Proteinkomplex-Montage und -Aktivität13. Weitere Beispiele für iPs Regulatorische Funktion sind die Kontrolle der Chromatin-Organisation21, RNA-Transport22,23, RNA-Editing24und Transkription1,2,3 . Im Gegensatz dazu werden PIs oft mit der Rekrutierung von Proteinen an die Plasmamembran oder Organelle Membranen25assoziiert. Eine neu entstehende Eigenschaft von PIs ist jedoch die Fähigkeit, mit Proteinen in einer nicht-membranösen Umgebungzuassoziieren 3,15,19,26. Dies ist der Fall des steroidogenen Kernrezeptors, dessen Transkriptionskontrollfunktion durch PI(3,4,5)P319reguliert wird, und Poly-A-Polymerase, deren enzymatische Aktivität durch kerntechnische PI(4,5)P226reguliert wird. Eine regulierende Rolle für IPs und PIs wurde in vielen Organismen gezeigt, einschließlich Hefe22,27, Säugetierzellen19,23, Drosophila10 und Würmer28. Von Bedeutung ist die Rolle dieser Metaboliten bei Trypanosomen, die früh von der eukaryotischen Abstammung abwichen. Diese Metaboliten spielen eine wesentliche Rolle bei Trypanosoma brucei Transkriptionskontrolle1,3, Entwicklung8, Organelle Biogenese und Proteinverkehr29,30 , 31 , 32, und sind auch an der Kontrolle der Entwicklung und Infektion in den Erregern T. cruzi33,34,35,Toxoplasma36 und Plasmodium beteiligt 5 , 37. Daher kann das Verständnis der Rolle von IPs und PIs bei Trypanosomen dazu beitragen, neue biologische Funktionen für diese Moleküle aufzuklären und neue Wirkstoffziele zu identifizieren.

Die Spezifität von Protein- und IP- oder PI-Bindung hängt von Protein-Interagierenden Domänen und dem Phosphorylierungszustand des Inositols13,38ab, obwohl Wechselwirkungen mit dem Lipidteil von PIs ebenfalls 19 auftreten. Die Vielfalt der IPs und PIs und ihre modifizierenden Kinoseen und Phosphatasen bieten einen flexiblen zellulären Mechanismus zur Kontrolle der Proteinfunktion, der durch die Verfügbarkeit und Häufigkeit von Metaboliten, den Phosphorylierungszustand des Inositols und das Protein beeinflusst wird. Affinität der Interaktion1,3,13,38. Obwohl einige Proteindomänen gut charakterisiert sind39,40,41, z.B. Pleckstrin-Homologie-Domäne42 und SPX (SYG1/Pho81/XPR1) Domains43 ,44,45, einige Proteine interagieren mit IPs oder PIs durch Mechanismen, die unbekannt bleiben. Zum Beispiel fehlt dem Repressor-Aktivator-Protein 1 (RAP1) von T. brucei kanonische PI-bindende Domänen, sondern interagiert mit PI(3,4,5)P3 und kontrolliert die Transkription von Genen, die an antigener Variation beteiligt sind3. Affinitätschromatographie und Massenspektrometrieanalyse von IP- oder PI-interagierenden Proteinen aus Trypanosom-, Hefe- oder Säugetierzellen identifizierten mehrere Proteine ohne bekannte IP- oder PI-bindende Domänen8,46, 47. Die Daten deuten auf zusätzliche nicht charakterisierte Proteindomänen hin, die an diese Metaboliten binden. Daher kann die Identifizierung von Proteinen, die mit IPs oder PIs interagieren, neue Mechanismen der Protein-Metabolit-Interaktion und neue zelluläre Regulierungsfunktionen für diese kleinen Moleküle offenbaren.

Die hier beschriebene Methode verwendet Affinitätschromatographie gekoppelt mit western blotting oder Massenspektrometrie, um Proteine zu identifizieren, die an IPs oder PIs binden. Es verwendet biotinylierte IPs oder PIs, die entweder mit Streptavidin verbunden sind, konjugiert mit Agaroseperlen oder alternativ über streptavidin-konjugierte Magnetperlen gefangen werden (Abbildung 1). Die Methode bietet einen einfachen Workflow, der empfindlich, nicht radioaktiv, liposomenfrei ist und sich zum Nachweis der Bindung von Proteinen aus Zelllysaten oder gereinigten Proteinen eignet3 (Abbildung 2). Das Verfahren kann in etikettenfreien8,46 oder gekoppelt an Aminosäure-markierte quantitative Massenspektrometrie47 verwendet werden, um IP- oder PI-bindende Proteine aus komplexen biologischen Proben zu identifizieren. Daher ist diese Methode eine Alternative zu den wenigen verfügbaren Methoden, um die Wechselwirkung von IPs oder PIs mit zellulären Proteinen zu untersuchen und wird dazu beitragen, die regulatorische Funktion dieser Metaboliten bei Trypanosomen und vielleicht anderen Eukaryoten zu verstehen.

Protocol

1. Analyse von IP- oder PI-bindenden Proteinen durch Affinitätschromatographie und Western Blotting Zellwachstum, Lyse und Affinitätschromatographie Wachsen Sie T. brucei-Zellen bis zur Mid-Log-Phase und überwachen Sie die Zelllebensfähigkeit und -dichte. Insgesamt reichen 5,0 x 107 Zellen für einen Bindungstest aus. Bei Blutkreislaufformen wachsen Zellen in HMI-9-Medien, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) bei 37 °C und 5%CO2. Halten…

Representative Results

Analyse der RAP1- und PI(3,4,5)P3-Wechselwirkung durch Affinitätschromatographie und Western BlottingDieses Beispiel veranschaulicht die Anwendung dieser Methode zur Analyse der Bindung von PIs durch RAP1 aus T. brucei lysate oder durch rekombinantes T. brucei RAP1-Protein. Lysate von T. brucei Blutbahnformen, die Hemagglutinin (HA)-getaggt RAP1 ausdrücken, wurden in Bindungstests verwendet. RAP1 ist ein Protein, das an der transkriptionellen Kontrolle der Varianten-Oberf…

Discussion

Die Identifizierung von Proteinen, die an IPs oder PIs binden, ist entscheidend, um die zelluläre Funktion dieser Metaboliten zu verstehen. Die Affinitätschromatographie, gekoppelt mit der Westlichen Fleck- oder Massenspektrometrie, bietet die Möglichkeit, IP- oder PI-interagierende Proteine zu identifizieren und so Einblicke in ihre regulatorische Funktion zu gewinnen. IPs oder PIs, die chemisch getaggt sind [z.B., Ins(1,4,5)P3, die chemisch mit Biotin verbunden sind] und über Streptavidin mit Agaroseperlen verbunde…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC, RGPIN-2019-04658) unterstützt. NSERC Discovery Launch Supplement for Early Career Researchers (DGECR-2019-00081) und von der McGill University.

Materials

Acetone Sigma-Aldrich 650501 Ketone
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004 Solvent 
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich A6141 Inorganic salt
Centrifuge Avanti J6-MI Beckman Coulter Avanti J6-MI Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)
Centrifuge botles Sigma-Aldrich B1408 Bottles for centrifugation of 1L of culture
Control Beads Echelon P-B000-1ml Affinity chromatography reagent – control
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Sugar, Added in PBS to keep cells viable
Dithiothreitol (DTT)  Bio-Rad 1610610 Reducing agent
Dynabeads M-270 Streptavidin ThermoFisher Scientific 65305 Streptavidin beads for binding to biotin ligands
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001 Protease inhibitors
Electrophoresis running buffer Bio-Rad 1610732 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning Life Sciences 430052 To centrifuge 10 mL cultures
Formic acid Sigma-Aldrich 106526 Acid
Glycine Sigma-Aldrich G7126 Amino acid
HMI-9 cell culture medium ThermoFisher Scientific ME110145P1 Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms
Imperial Protein Stain ThermoFisher Scientific 24615 Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 Beads Echelon Q-B0145-1ml Affinity chromatography reagent 
Instant Nonfat Dry Milk Thomas Scientific C837M64 Blocking reagent for Western blotting
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125 Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides
Lab Rotator Thomas Scientific 1159Z92 For binding assays
LoBind Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 13-698-793 Low protein binding tubes for mass spectrometry
Nonidet P-40 (Igepal CA-630) Sigma-Aldrich 21-3277 Detergent
PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010031 Physiological buffer
Peroxidase substrate for chemiluminescence ThermoFisher Scientific 32106 Substrate for Western bloting detection of proteins
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche 4906845001 Phosphatase inhibitors
PI(3)P PIP Beads Echelon P-B003a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4)P2 PIP Beads Echelon P-B034a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 diC8 Echelon P-3908-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 PIP Beads Echelon P-B345a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,5)P2 PIP Beads Echelon P-B035a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4)P PIP Beads Echelon P-B004a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 diC8 Echelon P-4508-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 PIP Beads Echelon P-B045a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(5)P PIP Beads Echelon P-B005a-1ml Affinity chromatography reagent 
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170 Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)
Potassium hexacyanoferrate(III) Sigma-Aldrich 702587 Potassium salt 
PtdIns PIP Beads Echelon P-B001-1ml Affinity chromatography reagent 
PVDF Membrane Bio-Rad 1620177 For Western blotting 
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5910 R Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 862010 Detergent
Sodium thiosulfate Sigma-Aldrich 72049 Chemical 
SpeedVac Vacuum Concentrators ThermoFisher Scientific SPD120-115 Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)
T175 flasks for cell culture  ThermoFisher Scientific 159910 To grow 50 mL T. brucei culture
Trypsin, Mass Spectrometry Grade Promega V5280 Trypsin for protein digestion
Urea Sigma-Aldrich U5128 Denaturing reagent
Vortex Fisher Scientific 02-215-418 For mixing reactions
Western blotting transfer buffer Bio-Rad 1610734 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol
Whatman 3 mm paper Sigma-Aldrich WHA3030861 Paper for Wester transfer
2-mercaptoethanol (14.2 M) Bio-Rad 1610710 Reducing agent
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Protein loading buffer
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 4561094 Gel for protein electrophoresis
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Protein loading buffer
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References

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Cestari, I. Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (149), e59865, doi:10.3791/59865 (2019).
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