Analisi anticorp-free per l'analisi dell'attività di RNA methyltransferase
Summary
Qui, viene descritto un saggio in vitro privo di anticorpi per l’analisi diretta dell’attività di metiltransferasi sull’RNA transscritto sintetico o in vitro.
Abstract
Ci sono più di 100 modifiche chimicamente distinte dell’RNA, due terzi delle quali consistono di metilazioni. L’interesse per le modifiche dell’RNA, e in particolare le metilazioni, è riemerso a causa dei ruoli importanti svolti dagli enzimi che li scrivono e li cancellano nei processi biologici rilevanti per la malattia e il cancro. Qui, viene fornito un saggio in vitro sensibile per un’analisi accurata dell’attività degli autori di metilazione dell’RNA sugli RNA trascritti sintetici o in vitro. Questo saggio utilizza una forma tritiata di S-adenosyl-methionine, con conseguente etichettatura diretta dell’RNA metilato con trizio. La bassa energia della radiazione di trizio rende il metodo sicuro, e i metodi preesistenti di amplificazione del segnale di trizio, consentono di quantificare e visualizzare l’RNA metilato senza l’uso di anticorpi, che sono comunemente inclini a manufatti. Mentre questo metodo è scritto per la metilazione dell’RNA, poche modifiche lo rendono applicabile allo studio di altre modifiche dell’RNA che possono essere etichettate radioattivamente, come l’acetilazione dell’RNA con coenzima acetil 14C A. Nel complesso, questo saggio consente di valutare rapidamente l’RNA condizioni di metilazione, inibizione con piccoli inibitori molecolari, o l’effetto di mutanti di RNA o enzimi, e fornisce un potente strumento per convalidare ed espandere i risultati ottenuti nelle cellule.
Introduction
Il DNA, l’RNA e le proteine sono soggetti a modifiche che regolano strettamente l’espressione genica1. Tra queste modifiche, le metilazioni si verificano su tutti e tre i biopolimeri. Le metilazioni del DNA e delle proteine sono state studiate molto bene negli ultimi tre decenni. Al contrario, l’interesse per la metilazione dell’RNA è stato riacceso solo di recente alla luce dei ruoli importanti che le proteine che scrivono, cancellano o legano le metilazioni dell’RNA giocano nello sviluppo e nella malattia2. Oltre alle funzioni più conosciute negli ABbondanti RNA ribosomici e di trasferimento, le vie di metilazione dell’RNA regolano la stabilità specifica dell’RNA messaggero3,4, splicing5 e traduzione6,7, Elaborazione miRNA8,9 e pausa trascrizionale e rilascio10,11.
Qui, viene riportato un metodo semplice e robusto per la verifica in vitro dell’attività di metiltransferasi dell’RNA nell’impostazione di un laboratorio di biologia molecolare (riassunto nella Figura 1). Molti studi valutano l’attività di un RNA metiltransferase attraverso dot-blot con un anticorpo contro la modificazione dell’RNA di interesse. Tuttavia, dot-blot non verifica l’integrità dell’RNA in caso di incubazione con l’RNA metiltransferase. Questo è importante perché anche piccole contaminazioni di proteine ricombinanti con nucleasi possono portare a parziale degradazione dell’RNA e risultati confusi. Inoltre, anche gli anticorpi altamente specifici per la modificazione dell’RNA possono riconoscere gli RNA non modificati con sequenze o strutture specifiche. Il saggio di metiltransferasi in vitro di RNA qui riportato sfrutta il fatto che la methionina S-adenosyl può essere tritiata sul donatore di gruppo metilico (Figura 1), consentendo l’rilevazione accurata dell’RNA metilato senza l’uso di anticorpi . Vengono fornite istruzioni per la trascrizione in vitro e la purificazione di una trascrizione di interesse e di test della metilazione di tale trascrizione da parte dell’enzima di interesse. Questo metodo è flessibile e robusto e può essere regolato in base alle esigenze di un determinato progetto. Ad esempio, possono essere utilizzati RNA in vitro trascritti e purificati, RNA sintetizzati chimicamente, ma anche RNA cellulari. Questo saggio fornisce informazioni quantitative sotto forma di conteggi scintilliali, così come informazioni qualitative mostrando dove esattamente l’RNA metilato viene eseguito su un gel. Questo può fornire una visione unica della funzione di una metiltransferasi dell’RNA, in particolare quando si utilizzano RNA cellulari come substrato, in quanto fornisce un metodo per osservare direttamente le dimensioni dell’RNA o degli RNA che sono mirati alla metilazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, viene riportato un metodo semplice e robusto per la verifica in vitro dell’attività di metiltransferasi dell’RNA verso trascrizioni specifiche. Il saggio sfrutta il fatto che la methionina S-adenosil può essere tritiata sul donatore del gruppo metilico (Figura 1), consentendo di rilevare con precisione l’RNA metilato senza l’uso di anticorpi. Tuttavia, è importante notare che questo saggio non può indicare quale residuo o gruppo chimico è metilato dall’enzima. Per identificare o ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Turja Kanti Debnath per il suo aiuto con ChemDraw. La ricerca nel laboratorio di Xhemalèe è supportata dal Department Of Defense – Congressionally Directed Medical Research Program – Breast Cancer Breakthrough Award (W81XWH-16-1-0352), NIH Grant R01 GM127802 e fondi di start-up dell’Istituto Biologia molecolare e College of Natural Sciences presso l’Università del Texas ad Austin, USA.
Materials
| 10 bp DNA Ladder | Invitrogen | 10821-015 | 10 bp DNA Ladder kit. |
| 10% Ammonium Persulfate (APS) | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 µm filter). |
| 10X TBE Buffer | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22µm filter). |
| 10X TBS | N/A | N/A | For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 µm filter. |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher | BP1408-1 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H]) | Perkin Elmer | NET155V250UC | For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM. Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4°C, make 20 µL aliquots, and freeze them at -30°C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot. |
| Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes | GE Healthcare | RPN11649 | For autoradiogram gel exposure. |
| Amersham Hyperfilm MP | GE Healthcare | 28906846 | For autoradiogram gel exposure. |
| Beckman Scintillation Counter | Beckman | LS6500 | For liquid scintillation count. |
| Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System | Biorad | 1704466 | Mini Horizontal Electrophoresis System. |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Applied Science | 4693159001 | For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water. |
| Criterion Cell | Biorad | 345-9902 | RNase free empty cassette for polyacrylamide gel. |
| Criterion empty Cassettes | Biorad | 1656001 | Vertical midi-format electrophoresis cell. |
| DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer | DeNovix | DS-11-S | Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration. |
| Ecoscint Original | National Diagnostics | LS-271 | For liquid scintillation count. |
| Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials | Fisher | 03-337-1 | For liquid scintillation count. |
| Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer | RPI CORP | 112600 | For autoradiogram gel pretreatment. |
| Gel dryer | Biorad | 1651745 | For drying gel. |
| Gel Loading Buffer II | Ambion | AM8547 | For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue). |
| GeneCatcher disposable gel excision tips | Gel Company | NC9431993 | For removing bands from agarose and polyacrylamide gels. |
| Megascript Kit | Ambion | AM1333 | For in vitro transcription with T7 RNA polymerase. |
| Perfectwestern Extralarge Container | Genhunter Corporation | NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black) | Gel staining box. |
| pRZ | Addgene | #27663 | Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends |
| Qiagen RNeasy MinElute Cleanup | Qiagen | 74204 | For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol. |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription. |
| Saran Premium Plastic Wrap | Saran Wrap | Amazon | For drying gel. |
| SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | Ultra sensitive nucleic acid gel stain. |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Nucleic acid gel stain. |
| TE | Sigma | 93283-100ML | 10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0 |
| TEMED | Fisher | 110-18-9 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES | eppendorf | 5382000023/5361000038 | For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes. |
| TOPO TA Cloning Kit | life technologies | Kits for fast cloning of Taq polymerase–amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription. | |
| TURBO DNase (2 U⁄µL) | Ambion | AM2238 | For DNA removal from in vitro transcription reactions. |
| Urea | Sigma | 51456-500G | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Whatman 3MM paper | GE Healthcare | 3030-154 | Chromatography paper for drying gel. |
References
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