Антитела-бесплатный анализ для анализа активности РНК метилтрансферазы
Summary
Здесь описывается анализ антител без пробирки для прямого анализа активности метилтрансферазы на синтетической или в пробирке транскрибированной РНК.
Abstract
Существует более 100 химически различных модификаций РНК, две трети из которых состоят из метилирования. Интерес к изменениям РНК, и особенно метилирования, вновь появился из-за важной роли, которую играют ферменты, которые пишут и стирают их в биологических процессах, имеющих отношение к болезням и раку. Здесь, чувствительный анализ in vitro для точного анализа деятельности писателя метилирования РНК на синтетических или in vitro транскрибированных РНК предоставляется. В этом ассее используется тритированная форма S-аденосил-метионина, что приводит к прямой маркировке метилированной РНК тритием. Низкая энергия излучения трития делает метод безопасным, а уже существующие методы усиления сигнала трития позволяют количественно и визуализировать метилированную РНК без использования антител, которые обычно подвержены артефактам. Хотя этот метод написан для РНК метилирования, несколько настроек сделать его применимым к изучению других изменений РНК, которые могут быть радиоактивно помечены, такие как РНК ацетилирование с 14C ацетил кофермент A. В целом, этот вывод позволяет быстро оценить РНК метилирование условия, ингибирование с небольшими ингибиторами молекулы, или эффект РНК или фермента мутантов, и обеспечивает мощный инструмент для проверки и расширения результатов, полученных в клетках.
Introduction
ДНК, РНК и белки подвержены изменениям, которыежестко регулируют экспрессию генов 1. Среди этих модификаций метилирование происходит на всех трех биополимерах. Метилирование ДНК и белка было очень хорошо изучено в течение последних трех десятилетий. В отличие от этого, интерес к метилированию РНК был только недавно возродился в свете важной роли, что белки, которые пишут, стирают или связывают РНК метилациляции играют в развитии и болезни2. В дополнение к более известным функциям в обильных рибосомных и передачи РНК, РНК метилирования пути регулируют конкретные посыльного РНК стабильности3,4, сращивание5 и перевод6,7, miRNA обработки8,9 и транскрипционной паузы и выпуска10,11.
Здесь сообщается о простом и надежном методе проверки РНК-метилтрансферазы в условиях лаборатории молекулярной биологии (обобщено на рисунке 1). Многие исследования оценивают активность РНК метилтрансферазы через точечную подрамность с антителом против изменения интереса РНК. Однако, точка-блот не проверяет целостность РНК при инкубации с метилтрансферазой РНК. Это важно, потому что даже незначительные загрязнения рекомбинантных белков с нуклеазой может привести к частичной деградации РНК и смешанные результаты. Более того, даже высокоспецифические антитела к модификации РНК могут распознавать неизмененные РНК с определенными последовательностями или структурами. In vitro RNA метилтрансферазы анализ сообщил здесь использует тот факт, что S-аденосил метионин может быть трилциатна на метиловой группы донора (Рисунок 1), что позволяет метилированной РНК быть точно обнаружены без использования антител . Инструкции предусмотрены для экстракорпорной транскрипции и очистки стенограммы интереса и тестирования метилирования указанной транскрипта ферментом интереса. Этот метод является гибким и надежным и может быть скорректирован в соответствии с потребностями того или иного проекта. Например, в пробирке транскрибируются и очищены РНК, химически синтезированные РНК, но и клеточные РНК могут быть использованы. Этот ассси обеспечивает количественную информацию в виде сцинтилляции, а также качественную информацию, показывая, где именно метилированная РНК работает на геле. Это может обеспечить уникальное понимание функции РНК метилтрансферазы, особенно при использовании клеточных РНК в качестве субстрата, так как он обеспечивает метод непосредственного наблюдения размер РНК или РНК, которые предназначены для метилирования.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь сообщается о простом и надежном методе проверки РНК-метилтрансферазы в отношении конкретных транскриптов. Ассаи использует тот факт, что S-аденосил метионин может быть тритиациарет на метилгруппы донора(рисунок 1), что позволяет метилированной РНК быть точно обна…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Турью Канти Дебнатх за помощь в ChemDraw. Исследования в лаборатории Xhemal’e поддерживается Министерством обороны – Конгресс направлены медицинские исследования программы – Рак молочной железы Прорыв премии (W81XWH-16-1-0352), NIH Грант R01 GM127802 и запуск средств от Института сотовой и Молекулярная биология и Колледж естественных наук техасского университета в Остине, США.
Materials
| 10 bp DNA Ladder | Invitrogen | 10821-015 | 10 bp DNA Ladder kit. |
| 10% Ammonium Persulfate (APS) | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 µm filter). |
| 10X TBE Buffer | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22µm filter). |
| 10X TBS | N/A | N/A | For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 µm filter. |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher | BP1408-1 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H]) | Perkin Elmer | NET155V250UC | For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM. Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4°C, make 20 µL aliquots, and freeze them at -30°C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot. |
| Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes | GE Healthcare | RPN11649 | For autoradiogram gel exposure. |
| Amersham Hyperfilm MP | GE Healthcare | 28906846 | For autoradiogram gel exposure. |
| Beckman Scintillation Counter | Beckman | LS6500 | For liquid scintillation count. |
| Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System | Biorad | 1704466 | Mini Horizontal Electrophoresis System. |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Applied Science | 4693159001 | For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water. |
| Criterion Cell | Biorad | 345-9902 | RNase free empty cassette for polyacrylamide gel. |
| Criterion empty Cassettes | Biorad | 1656001 | Vertical midi-format electrophoresis cell. |
| DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer | DeNovix | DS-11-S | Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration. |
| Ecoscint Original | National Diagnostics | LS-271 | For liquid scintillation count. |
| Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials | Fisher | 03-337-1 | For liquid scintillation count. |
| Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer | RPI CORP | 112600 | For autoradiogram gel pretreatment. |
| Gel dryer | Biorad | 1651745 | For drying gel. |
| Gel Loading Buffer II | Ambion | AM8547 | For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue). |
| GeneCatcher disposable gel excision tips | Gel Company | NC9431993 | For removing bands from agarose and polyacrylamide gels. |
| Megascript Kit | Ambion | AM1333 | For in vitro transcription with T7 RNA polymerase. |
| Perfectwestern Extralarge Container | Genhunter Corporation | NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black) | Gel staining box. |
| pRZ | Addgene | #27663 | Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends |
| Qiagen RNeasy MinElute Cleanup | Qiagen | 74204 | For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol. |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription. |
| Saran Premium Plastic Wrap | Saran Wrap | Amazon | For drying gel. |
| SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | Ultra sensitive nucleic acid gel stain. |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Nucleic acid gel stain. |
| TE | Sigma | 93283-100ML | 10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0 |
| TEMED | Fisher | 110-18-9 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES | eppendorf | 5382000023/5361000038 | For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes. |
| TOPO TA Cloning Kit | life technologies | Kits for fast cloning of Taq polymerase–amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription. | |
| TURBO DNase (2 U⁄µL) | Ambion | AM2238 | For DNA removal from in vitro transcription reactions. |
| Urea | Sigma | 51456-500G | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Whatman 3MM paper | GE Healthcare | 3030-154 | Chromatography paper for drying gel. |
References
- Xhemalce, B. From histones to RNA: role of methylation in cancer. Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).
- Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway. PLoS Genetics. 12 (7), 1006139 (2016).
- Mauer, J., et al. Reversible methylation of m(6)Am in the 5′ cap controls mRNA stability. Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).
- Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
- Pendleton, K. E., et al. The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention. Cell. 169 (5), 824-835 (2017).
- Meyer, K. D., et al. 5′ UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation. Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).
- Wang, X., et al. N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency. Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).
- Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing. Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).
- Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing. Cell. 151 (2), 278-288 (2012).
- Jeronimo, C., et al. Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme. Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).
- Liu, W., et al. Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release. Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visual Experimentation. , (2019).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visual Experimentation. (63), e3998 (2012).
- Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. Template strand switching by T7 RNA polymerase. Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).
- Rio, D. C. Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli. Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).
- Shelton, S. B., et al. Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin. Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).
- Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends. Nucleic Acids Research. 31 (15), 82 (2003).
- Blazer, L. L., et al. A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D. SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).
- Arango, D., et al. Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency. Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).
- Ito, S., et al. Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA). Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).
