RNAメチルトランスフェラーゼ活性分析のための抗体フリーアッセイ
Summary
ここで、合成またはインビトロ転写RNA上のメチルトランスフェラーゼ活性の直接分析のための抗体フリーインインビトロアッセイが記載されている。
Abstract
RNAには100以上の化学的に異なる修飾があり、そのうちの3分の2はメチル化からなる。RNA修飾、特にメチル化への関心は、疾患や癌に関連する生物学的プロセスでそれらを書き、消去する酵素が果たしている重要な役割のために再浮上しました。ここで、合成またはインビトロ転写RNA上のRNAメチル化ライタ活性の正確な分析のためのインビトロアッセイに敏感なアッセイが提供される。このアッセイは、S-アデノシルメチオニンのトリチレートされた形態を使用し、トリチウムを用いてメチル化RNAを直接標識する。トリチウム放射線の低エネルギーは、この方法を安全にし、トリチウム信号増幅の既存の方法により、一般的に人工物になりやすい抗体を使用せずにメチル化RNAを定量化および可視化することを可能にします。この方法はRNAメチル化のために書かれていますが、14CアセチルコエンザイムA.を用いたRNAアセチル化など、放射性標識が可能な他のRNA修飾の研究に適用可能な調整はほとんどありません。メチル化条件、低分子阻害剤による阻害、またはRNAまたは酵素変異体の効果、および細胞で得られた結果を検証し、拡大するための強力なツールを提供する。
Introduction
DNA、RNAおよびタンパク質は、遺伝子発現1を厳密に調節する修飾の対象となる。これらの修飾の中で、メチル化は3つの生体高分子すべてに起こる。DNAとタンパク質のメチル化は、過去30年間に非常によく研究されています。対照的に、RNAメチル化への関心は、RNAメチル化を書き込み、消去、または結合するタンパク質が発達および疾患2において果たす重要な役割に照らして、最近再燃したばかりである。豊富なリボソームおよび転写RNAにおけるよりよく知られた機能に加えて、RNAメチル化経路は、特異的メッセンジャーRNA安定性3、4、スプライシング5および翻訳6、7を調節する。miRNA処理8、9および転写休止および放出10、11.
ここで、分子生物学研究室の設定におけるRNAメチルトランスフェラーゼ活性のインビトロ検証のための簡素かつ堅牢な方法が報告されている(図1に要約)。多くの研究は、目的のRNA修飾に対する抗体を有するドットブロットを介してRNAメチルトランスフェラーゼの活性を評価する。しかしながら、ドットブロットは、RNAメチルトランスフェラーゼとのインキュベーション時にRNAの完全性を検証しない。ヌクレアーゼを用いた組換えタンパク質のわずかな汚染でさえ、部分的なRNA分解と交絡の結果につながる可能性があるため、これは重要です。さらに、非常に特異的なRNA修飾抗体でさえ、特定の配列または構造を持つ未修飾RNAを認識することができます。ここで報告されるインビトロRNAメチルトランスフェラーゼアッセイは、S-アデノシルメチオニンをメチル基ドナー上でトリチレートできるという事実を利用し(図1)、メチル化されたRNAを抗体を使用せずに正確に検出できるようにする.インビトロ転写および目的の酵素による前記転写のメチル化の試験の転写および精製のための指示が提供される。この方法は柔軟で堅牢であり、特定のプロジェクトのニーズに応じて調整できます。例えば、インビトロ転写および精製RNA、化学的に合成されたRNA、ならびに細胞RNAを用いることができる。このアッセイは、シンチレーションカウントの形で定量的な情報を提供するだけでなく、メチル化されたRNAがゲル上で正確に実行される場所を示すことによって定性的情報を提供します。これは、特に細胞RNAを基板として使用する場合に、メチル化の標的となるRNAまたはRNAのサイズを直接観察する方法を提供するため、RNAメチルトランスフェラーゼの機能に関するユニークな洞察を提供することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで、特定の転写物に向けたRNAメチルトランスフェラーゼ活性のインビトロ検証のための簡素かつ堅牢な方法が報告されている。このアッセイは、S-アデノシルメチオニンをメチル基ドナー(図1)でトリチレートできるという事実を利用して、メチル化RNAを抗体を使用せずに正確に検出することができます。しかし、このアッセイは、どの残基または化学基が酵素によ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者たちは、ChemDrawに対する彼の助けに対して、トゥルジャ・カンティ・デブナート博士に感謝したいと思います。Xhemalçeラボでの研究は、国防総省によってサポートされています – 議会指向医学研究プログラム – 乳癌ブレークスルー賞(W81XWH-16-1-0352)、NIHグラントR01 GM127802および細胞研究所からのスタートアップ資金と米国オースティンのテキサス大学の分子生物学と自然科学のカレッジ。
Materials
| 10 bp DNA Ladder | Invitrogen | 10821-015 | 10 bp DNA Ladder kit. |
| 10% Ammonium Persulfate (APS) | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 µm filter). |
| 10X TBE Buffer | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22µm filter). |
| 10X TBS | N/A | N/A | For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 µm filter. |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher | BP1408-1 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H]) | Perkin Elmer | NET155V250UC | For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM. Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4°C, make 20 µL aliquots, and freeze them at -30°C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot. |
| Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes | GE Healthcare | RPN11649 | For autoradiogram gel exposure. |
| Amersham Hyperfilm MP | GE Healthcare | 28906846 | For autoradiogram gel exposure. |
| Beckman Scintillation Counter | Beckman | LS6500 | For liquid scintillation count. |
| Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System | Biorad | 1704466 | Mini Horizontal Electrophoresis System. |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Applied Science | 4693159001 | For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water. |
| Criterion Cell | Biorad | 345-9902 | RNase free empty cassette for polyacrylamide gel. |
| Criterion empty Cassettes | Biorad | 1656001 | Vertical midi-format electrophoresis cell. |
| DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer | DeNovix | DS-11-S | Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration. |
| Ecoscint Original | National Diagnostics | LS-271 | For liquid scintillation count. |
| Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials | Fisher | 03-337-1 | For liquid scintillation count. |
| Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer | RPI CORP | 112600 | For autoradiogram gel pretreatment. |
| Gel dryer | Biorad | 1651745 | For drying gel. |
| Gel Loading Buffer II | Ambion | AM8547 | For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue). |
| GeneCatcher disposable gel excision tips | Gel Company | NC9431993 | For removing bands from agarose and polyacrylamide gels. |
| Megascript Kit | Ambion | AM1333 | For in vitro transcription with T7 RNA polymerase. |
| Perfectwestern Extralarge Container | Genhunter Corporation | NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black) | Gel staining box. |
| pRZ | Addgene | #27663 | Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends |
| Qiagen RNeasy MinElute Cleanup | Qiagen | 74204 | For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol. |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription. |
| Saran Premium Plastic Wrap | Saran Wrap | Amazon | For drying gel. |
| SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | Ultra sensitive nucleic acid gel stain. |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Nucleic acid gel stain. |
| TE | Sigma | 93283-100ML | 10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0 |
| TEMED | Fisher | 110-18-9 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES | eppendorf | 5382000023/5361000038 | For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes. |
| TOPO TA Cloning Kit | life technologies | Kits for fast cloning of Taq polymerase–amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription. | |
| TURBO DNase (2 U⁄µL) | Ambion | AM2238 | For DNA removal from in vitro transcription reactions. |
| Urea | Sigma | 51456-500G | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Whatman 3MM paper | GE Healthcare | 3030-154 | Chromatography paper for drying gel. |
References
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