Ensayo libre de anticuerpos para el análisis de actividad de la metiltransferasa de ARN
Summary
Aquí, se describe un ensayo in vitro libre de anticuerpos para el análisis directo de la actividad de la metiltransferasa en ARN sintético o transcrito in vitro.
Abstract
Hay más de 100 modificaciones químicamente distintas del ARN, dos tercios de las cuales consisten en metilaciones. El interés por las modificaciones del ARN, y especialmente las metilaciones, ha resurgido debido a los importantes roles desempeñados por las enzimas que las escriben y borran en procesos biológicos relevantes para la enfermedad y el cáncer. Aquí, se proporciona un ensayo in vitro sensible para el análisis preciso de la actividad del escritor de metilación de ARN en ARN sintéticos o transcritos in vitro. Este ensayo utiliza una forma tritiada de S-adenosyl-metionina, lo que resulta en el etiquetado directo de ARN metilado con tritio. La baja energía de la radiación de tritio hace que el método sea seguro, y los métodos preexistentes de amplificación de la señal de tritio, permiten cuantificar y visualizar el ARN metilado sin el uso de anticuerpos, que son comúnmente propensos a los artefactos. Si bien este método está escrito para la metilación del ARN, pocos ajustes lo hacen aplicable al estudio de otras modificaciones de ARN que pueden ser etiquetadas radiactivamente, como la acetilación de ARN con 14C de coenzima A. En general, este ensayo permite evaluar rápidamente el ARN condiciones de metilación, inhibición con inhibidores de moléculas pequeñas, o el efecto de ARN o enzimas mutantes, y proporciona una poderosa herramienta para validar y expandir los resultados obtenidos en las células.
Introduction
El ADN, el ARN y las proteínas están sujetos a modificaciones que regulan estrechamente la expresión génica1. Entre estas modificaciones, las metilaciones se producen en los tres biopolímeros. El ADN y las metilaciones de proteínas han sido muy bien estudiados durante las últimas tres décadas. Por el contrario, el interés por la metilación del ARN se ha reinado recientemente a la luzde las importantes funciones que desempeñan las proteínas que escriben, borran o unen las metilaciones del ARN en el desarrollo y la enfermedad 2. Además de las funciones más conocidas en los abundantes ARN ribosomales y de transferencia, las vías de metilación del ARN regulan la estabilidad específica del ARN mensajero3,4, empalme5 y la traducción6,7, procesamiento de miRNA8,9 y pausa transcripcional y liberación10,11.
Aquí, se informa de un método simple y robusto para la verificación in vitro de la actividad de la met-fitransferasa de ARN en el entorno de un laboratorio de biología molecular (resumido en la Figura1). Muchos estudios evalúan la actividad de un ARN metiltransferasa a través de la mancha de puntos con un anticuerpo contra la modificación del interés del ARN. Sin embargo, el punto-blot no verifica la integridad del ARN al incubar con el ARN metiltransferasa. Esto es importante porque incluso pequeñas contaminaciones de proteínas recombinantes con nucleasas pueden conducir a la degradación parcial del ARN y resultados de confunción. Además, incluso los anticuerpos de modificación de ARN altamente específicos pueden reconocer ARN no modificados con secuencias o estructuras específicas. El ensayo de ARN metiltransferasa in vitro notificado aquí aprovecha el hecho de que la S-adenosyl metionina puede ser tritida en el donante del grupo metilo (Figura1), lo que permite que el ARN metilado se detecte con precisión sin el uso de anticuerpos . Se proporcionan instrucciones para la transcripción in vitro y la purificación de una transcripción de interés y pruebas de la metilación de dicha transcripción por la enzima de interés. Este método es flexible y robusto, y se puede ajustar de acuerdo a las necesidades de cualquier proyecto dado. Por ejemplo, se pueden utilizar ARN transcritos y purificados in vitro, ARN sintetizados químicamente, pero también ARN celulares. Este ensayo proporciona información cuantitativa en forma de recuentos de centelleo, así como información cualitativa al mostrar dónde se ejecuta exactamente el ARN metilado en un gel. Esto puede proporcionar una visión única de la función de un ARN metiltransferasa, particularmente cuando se utiliza ARN celulares como sustrato, ya que proporciona un método para observar directamente el tamaño del ARN o ARN que están dirigidos a la metilación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, se informa de un método simple y robusto para la verificación in vitro de la actividad de la metiltransferasa de ARN hacia transcripciones específicas. El ensayo aprovecha el hecho de que S-adenosyl metionina puede ser trititada en el donante del grupo metilo (Figura1), lo que permite que el ARN metilado se detecte con precisión sin el uso de anticuerpos. Sin embargo, es importante tener en cuenta que este ensayo no puede indicar qué residuo o grupo químico es metilado por la en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores quieren agradecer al Dr. Turja Kanti Debnath por su ayuda con ChemDraw. La investigación en el laboratorio xhemalé e cuenta con el apoyo del Departamento de Defensa – Programa de Investigación Médica Dirigido por el Congreso – Premio De ruptura del cáncer de mama (W81XWH-16-1-0352), NIH Grant R01 GM127802 y fondos de puesta en marcha del Instituto de Celulares y Biología Molecular y la Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad de Texas en Austin, EE. UU.
Materials
| 10 bp DNA Ladder | Invitrogen | 10821-015 | 10 bp DNA Ladder kit. |
| 10% Ammonium Persulfate (APS) | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 µm filter). |
| 10X TBE Buffer | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22µm filter). |
| 10X TBS | N/A | N/A | For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 µm filter. |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher | BP1408-1 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H]) | Perkin Elmer | NET155V250UC | For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM. Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4°C, make 20 µL aliquots, and freeze them at -30°C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot. |
| Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes | GE Healthcare | RPN11649 | For autoradiogram gel exposure. |
| Amersham Hyperfilm MP | GE Healthcare | 28906846 | For autoradiogram gel exposure. |
| Beckman Scintillation Counter | Beckman | LS6500 | For liquid scintillation count. |
| Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System | Biorad | 1704466 | Mini Horizontal Electrophoresis System. |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Applied Science | 4693159001 | For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water. |
| Criterion Cell | Biorad | 345-9902 | RNase free empty cassette for polyacrylamide gel. |
| Criterion empty Cassettes | Biorad | 1656001 | Vertical midi-format electrophoresis cell. |
| DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer | DeNovix | DS-11-S | Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration. |
| Ecoscint Original | National Diagnostics | LS-271 | For liquid scintillation count. |
| Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials | Fisher | 03-337-1 | For liquid scintillation count. |
| Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer | RPI CORP | 112600 | For autoradiogram gel pretreatment. |
| Gel dryer | Biorad | 1651745 | For drying gel. |
| Gel Loading Buffer II | Ambion | AM8547 | For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue). |
| GeneCatcher disposable gel excision tips | Gel Company | NC9431993 | For removing bands from agarose and polyacrylamide gels. |
| Megascript Kit | Ambion | AM1333 | For in vitro transcription with T7 RNA polymerase. |
| Perfectwestern Extralarge Container | Genhunter Corporation | NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black) | Gel staining box. |
| pRZ | Addgene | #27663 | Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends |
| Qiagen RNeasy MinElute Cleanup | Qiagen | 74204 | For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol. |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription. |
| Saran Premium Plastic Wrap | Saran Wrap | Amazon | For drying gel. |
| SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | Ultra sensitive nucleic acid gel stain. |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Nucleic acid gel stain. |
| TE | Sigma | 93283-100ML | 10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0 |
| TEMED | Fisher | 110-18-9 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES | eppendorf | 5382000023/5361000038 | For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes. |
| TOPO TA Cloning Kit | life technologies | Kits for fast cloning of Taq polymerase–amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription. | |
| TURBO DNase (2 U⁄µL) | Ambion | AM2238 | For DNA removal from in vitro transcription reactions. |
| Urea | Sigma | 51456-500G | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Whatman 3MM paper | GE Healthcare | 3030-154 | Chromatography paper for drying gel. |
References
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