Hücrelerdeki somatik mutasyon desenleri önceki mutajenik pozlamayı yansıtır ve gelişimsel soy ilişkilerini ortaya çıkarabilir. Burada sunulan bir metodoloji Katalog ve bireysel hematopoetik kök ve Progenitör hücrelerde somatik mutasyonları analiz etmektir.
Hematopoetik kök ve progenitör hücreler (hspcs), lösemi gibi yaşlarla ilişkili hastalıklara katkı sağlayan bir ömür süresince DNA mutasyonları giderek birikir. Mutasyon birikimi karakterize yaşlılık ilişkili hastalıkların etiyolojisi anlayışını artırabilir. Burada sunulan bireysel hspcs içinde somatik mutasyonlar Katalog için bir yöntemdir, tüm genom sıralamaları dayanmaktadır (WGS) klonal primer hücre kültürlerinin. Orijinal hücrede bulunan mutasyonlar, klonal kültürdeki tüm hücreler tarafından paylaşılır, ancak hücre sıralamadan sonra in vitro olarak elde edilen mutasyonlar hücrelerin bir alt kümesinde bulunur. Bu nedenle, bu yöntem, yaşam sırasında biriken bireysel HSPCs genomları mevcut somatik mutasyonların doğru tespiti için izin verir. Somatik mutasyonların bu katalogları, hematopoetik dokuda aktif olan mutasyonel süreçlere ve bu süreçlerin lötekjenlere nasıl katkıda bulunmasına ilişkin değerli öngörüler sağlayabilir. Buna ek olarak, aynı bireyin birden çok HSPCs arasında paylaşılan somatik mutasyonları değerlendirerek, klonal soy ilişkileri ve kan nüfuslarının nüfus dinamikleri tespit edilebilir. Bu yaklaşım tek hücrelerin in vitro genişlemesine dayandığı için, yöntem yeterli çoğalan potansiyele sahip hematopoetik hücrelerle sınırlıdır.
Hematopoetik kök ve progenitör hücrelerinin (hspcs) endojen veya ekstrensek mutajenik kaynaklara maruz kalması,1ömrü boyunca DNA ‘daki mutasyonların kademeli olarak birikmesine katkıda bulunur. Hspcs1 ‘ deki kademeli mutasyon birikimi, lösemi-sürücü mutasyonları taşıyan hspcs tarafından tahrik edilen semptomatik olmayan bir durum olan yaşla ilgili klonal hematopoezinin (Arch)2,3‘ te sonuçlanabilmektedir. Başlangıçta, kemer ile bireylerin lösemi için artan bir risk olduğunu düşünülmektedir2,3. Ancak, son çalışmalar eski bireyler4arch% 95 bir insidansı göstermiştir, malignite daha az net ile dernek yapma ve neden Arch ile bazı bireyler sonunda ya da malignite geliştirmek değil neden soru yükselterek. Yine de, HSPCs ‘deki somatik mutasyonlar ciddi sağlık riskleri teşkil edebilir, Miyelodisplastik bozukluklar ve lösemi belirli kanser sürücüsü mutasyonlarının varlığı ile karakterize edilir.
Mutasyonel süreçleri tanımlamak ve kan klonallık incelemek için, bireysel HSPCs mutasyon birikimi karakterize edilmesi gerekir. Mutasyonel süreçler genom, sözde mutasyon imzalarında karakteristik desenler bırakmak, hangi tespit edilebilir ve mutasyonlar genom genelinde koleksiyonları nicelik5. Örneğin, UV ışığa maruz kalma, alkilleyici ajanlar, ve DNA onarım yolları kusurları her biri farklı bir mutasyonel imza ile ilişkilidir,6,7. Buna ek olarak, mutasyon birikiminin Stokastik doğası nedeniyle, elde edilen mutasyonların çoğu (değilse) hücreler arasında benzersizdir. Mutasyonlar aynı bireyin birden çok hücre arasında paylaşılır, bu hücrelerin ortak bir üst8paylaştığı gösterir. Bu nedenle, paylaşılan mutasyonları değerlendirerek, Lineage ilişkileri hücreler arasında tespit edilebilir ve bir gelişimsel soy ağacı şube tarafından inşa edilebilir. Ancak, fizyolojik olarak normal hücrelerdeki nadir somatik mutasyonları kataloglama, sağlıklı dokularda poliklonal doğası nedeniyle Teknik olarak zordur.
Burada sunulan bir yöntem doğru tanımlamak ve bireysel HSPCs genomları somatik mutasyonlar belirlemek için. Bu, HSPCs in vitro yalıtım ve klonal genişleme içerir. Bu klonal kültürler orijinal hücrenin genetik makyajını yansıtmaktadır (yani orijinal hücredeki mutasyonlar kültürdeki diğer tüm hücreler tarafından paylaşılacaktır). Bu yaklaşım, tüm genom sıralamaları (WGS) için yeterli DNA elde etmemizi sağlar. Daha önce klonal kültürü sırasında in vitro olarak birikmiş mutasyonların hücrelerin bir alt kümesi tarafından paylaşılacak olduğunu gösterdik. Bu, tüm in vitro mutasyonların filtrelenmesini sağlar, çünkü in vivo elde edilen mutasyonlar9‘ a kıyasla daha küçük bir parça okunacak. Önceki yöntemler tüm genom amplifikasyon (WGA)10kullanarak WGS için tek bir hücreden yeterli DNA elde etmiştir. Ancak, WGA ana dezavantajı genom nispeten hata eğilimli ve dengesiz amplifikasyon olduğunu, hangi allel bırakma neden olabilir11. Bununla birlikte, bu yaklaşım tek hücrelerin in vitro genişlemesine dayanır gibi, WGA bağımlı yöntemler için değil, yeterli çoğalan potansiyel ile kan hücreleri ile sınırlıdır. Klonal kültürlerin sıralanması önceki çabaları tek hspcs12klonal amplifikasyon sağlamak için besleyici katmanları kullanarak güvenerek. Ancak, besleyici katmanlardan DNA potansiyel olarak klonal kültürlerin DNA ‘sını kirleterek, sonraki mutasyon çağırma ve filtreleme işlemini karıştırabilir. Burada sunulan yöntem sadece CL, tek HSPCs genişletmek için belirtilen orta dayanır ve bu nedenle DNA kontaminasyonu sorununu önler. Bugüne kadar, bu yöntem insan kemik iliği, kordon kanı, viably dondurulmuş kemik iliği ve periferik kan üzerinde başarıyla uyguladıysanız.
Burada sunulan, bireysel hkms ‘de yaşam sırasında birikmiş mutasyonları tespit etmek ve bu mutasyon verilerini kullanarak erken gelişimsel soy ağacı oluşturmak için bir yöntemdir.
Bu işlemleri başarıyla gerçekleştirmek için birkaç kritik gereksinim karşılanması gerekir. İlk olarak, numunenin canlılığı sağlanmalıdır. Numunenin hızlı işlenmesi, prosedürün verimliliğini sağlamak için anahtardır. İkinci olarak, büyüme faktörü gücü kaybı HSPCs ‘in klonal genişlemesini olumsuz yönde etkileyecektir. Yüksek büyüme faktörü potens sağlamak için, donma-çözülme döngüleri önlemek ve tek kullanımlık aliquots hazırlamak önemlidir. Üçüncü, WGS yaptıktan sonra, mutasyon arama ve filtreleme, klonal kültürün klonallık doğrulamak için çok önemlidir. Kültürün klonallık onaylamak için, mutasyonların VAF etrafında küme olmalıdır 0,5 karyotypically normal bir örnek (Şekil 3). Kordon kanı HSPCs gibi düşük mutasyonel yükü olan hücrelerde, düşük mutasyon numaraları nedeniyle klonallık belirlemek daha zordur.
Yaklaşımımız WGS için izin vermek için tek hücrelerin in vitro genişlemesine dayanır. Bu nedenle, yaklaşımımız, HSPCs gibi genişletmek için çoğallandırıcı potansiyele sahip hücrelere sınırlıdır. Bizim elimizde, tüm tek sıralı hücrelerin yaklaşık% 5-30% yeterince genişletmek edebiliyoruz. Azaltılmış büyüme oranları olası bir seçim önyargı neden olabilir. Daha önce de anlatıldığı gibi, bu teknik hücrelerin genişlemesine güvenmiyorsa, WGA kullanan Yöntemler bu seçim önyargı üstesinden gelebilir. Ancak, WGA kendi eksiklikleri vardır, ve klonal amplifikasyon doğru tüm genom içinde allelik bırakma ve genom boyunca eşit kapsama olmadan mutasyonların sayısını belirlemek için tek yöntem kalır, özellikle düşük gerçek somatik örnekleri mutasyon numaraları.
Bu yaklaşım kullanılarak oluşturulan veriler, tek hücrelerde algılanan mutasyonlar, Şekil 6‘ da tasvir edilen hücre sırlarını incelemek için kullanılabiliyor olduğu için, hematopoetik sistemin phylogenlerini belirlemek için kullanılabilir. Tipik olarak, bir veya iki mutasyon sağlıklı bir bağışçı1her şube tanımlayabilir. Bu yana, ilk dalları tanımlayan mutasyonlar, germline türevleri1,18,19filtreleme için kullanılan eşleşen normal örnekteki düşük VAF ile de mevcut olacaktır. Bu durumda, onlar hematopoetik sistemden gelişimi sırasında çok erken ayırmak için bekleniyor olarak MSCs gibi olmayan-hematopoetik hücrelerin kullanımı, tercih edilir. T-hücreler hematopoetik Orijin olduğu için, bu hücrelerin, germline türevleri filtrelemek için eşleşen normal bir örnek olarak kullanımı, bu nedenle gelişimsel soy ağacının en erken dallanma yapımında konabilir. Belirli olgun kan nüfusa şube özgü mutasyonların subclonal varlığı, hangi hedeflenen derin sıralamayı ile ölçülebilir, bu şube gençliğinde bu olgun hücre türüne yol verebilir gösterecektir. Buna ek olarak, yaklaşımımız, mutajisik pozlama içinde vivo ve sonuçta bunun lösemi gelişimine nasıl katkıda bulunabileceği mutasyonel sonuçları değerlendirmek için izin verir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışmada Hollanda bilimsel araştırmalar Örgütü (NWO) (No. 016. vidi. 171.023) için R. v. B ‘ye ait bir VIDI hibe tarafından destekleniyordu.
0.20 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
50 mL Syringe, Luer lock | BD | 613-3925 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50G | |
CD11c FITC | BioLegend | 301603 | Clone 3.9 |
CD16 FITC | BioLegend | 302005 | Clone 3G8 |
CD3 BV650 | Biolegend | 300467 | Clone UCHT1 |
CD34 BV421 | BioLegend | 343609 | 561 |
CD38 PE | BioLegend | 303505 | Clone HIT2 |
CD45RA PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 304121 | Clone HI100 |
CD49f PE/Cy7 | BioLegend | 313621 | Clone GoH3 |
CD90 APC | BioLegend | 328113 | Clone 5E10 |
Cell Strainer 5 mL tube | Corning | 352235 | |
CELLSTAR plate, 384w, 130 µL, F-bottom, TC, cover | Greiner | 781182 | |
Cryogenic vial | Corning | 430487 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DMEM/F12 | ThermoFisher | 61965059 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E4884-500G | |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 10500 | |
GlutaMAX | ThermoFisher | 25030081 | |
Human Flt3-Ligand, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-479 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78040.1 | Reconsititute in single-use aliquots (2.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78050.1 | Reconsititute in single-use aliquots (5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human SCF, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human TPO, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-095-752 | Reconsititute in single-use aliquots (12.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Integrative Genomics Viewer 2.4 | Broad Institute | https://software.broadinstitute.org/software/igv/download | |
Iscove's Modified Eagle's Medium | ThermoFisher | 12440061 | |
Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC | BioLegend | 348701 | Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56 |
Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07861 | Used for Density gradient separation |
PBS | Made in at Institute's facility. Commerically available PBS can also be used | ||
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antibiotic formulation |
QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
Qubit 2.0 fluorometer | ThermoFisher | Q32866 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32854 | |
RNAse A | Qiagen | 19101 | |
SH800S Cell Sorter | Sony | SH800S | |
StemSpan SFEM, 500mL | Stem Cell Technologies | 9650 | |
TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA | G-Biosciences | 786-151 | |
TrypLE Express | ThermoFisher | 12605-10 |