细胞体突变模式反映先前突变暴露,可以揭示发育系系关系。这里介绍的是一种对单个造血干细胞和祖细胞的体细胞突变进行编目和分析的方法。
造血干细胞和祖细胞(HSPCs)在一生中逐渐积累DNA突变,这可能导致与年龄相关的疾病,如白血病。特征突变积累可以增进对年龄相关疾病病因的了解。这里介绍的是一种对单个HSPCs的体细胞突变进行编目的方法,该方法基于克隆原细胞培养的全基因组测序(WGS)。原始细胞中存在的突变由克隆培养中的所有细胞共享,而细胞分类后在体外获得的突变存在于细胞的一个子集中。因此,这种方法可以准确检测个体HSPCs基因组中存在的体细胞突变,这些突变在生命过程中积累。这些体细胞突变目录可以为活跃于造血组织的突变过程以及这些过程如何促进白细胞生成提供有价值的见解。此外,通过评估同一个体的多个HSPCs之间共享的体细胞突变,可以确定血型的克隆系关系和种群动态。由于这种方法依赖于单个细胞的体外扩张,该方法仅限于具有足够复制潜力的造血细胞。
造血干细胞和祖细胞(HSPCs)暴露于内源或外源诱变源,有助于在寿命1期间逐渐积累DNA突变。HSPCs1的逐渐突变积累可导致与年龄相关的克隆血球(ARCH) 2、3,这是一种由携带白血病驱动突变的HSPCs驱动的非症状性疾病。最初,人们认为有ARCH的人有增加的风险白血病2,3。然而,最近的研究表明,在老年人4的ARCH发病率为95%,使得与恶性肿瘤的关联不那么明显,并引发了为什么一些患有ARCH的人最终是否患有恶性肿瘤的问题。然而,HSPCs的体细胞突变可能造成严重的健康风险,因为骨髓增生障碍和白血病的特点是存在特定的癌症驱动因素突变。
为了识别突变过程和研究血液克隆性,需要对单个HSPCs的突变积累进行特征化。突变过程在基因组中留下特征模式,即所谓的突变特征,可以在全基因组突变集合中识别和量化。例如,暴露于紫外线、烷基化剂和DNA修复途径的缺陷都与不同的突变特征6,7相关。此外,由于突变积累的随机性质,大多数(如果不是全部)获得突变在细胞之间是唯一的。如果突变在同一个体的多个细胞之间共享,则表明这些细胞共享一个共同的祖先8。因此,通过评估共享突变,可以确定细胞之间的谱系关系,并且可以分支构造发育谱系树。然而,由于健康组织的多克隆性质,在生理正常细胞中编目罕见的体细胞突变在技术上具有挑战性。
这里介绍的是一种准确识别和确定单个HSPCs基因组中体细胞突变的方法。这涉及到在体外HSPCs的分离和克隆扩张。这些克隆培养体反映了原始细胞的基因组成(即原始细胞中的突变将由培养基中的所有其他细胞共享)。这种方法使我们能够获得足够的DNA进行全基因组测序(WGS)。我们之前已经表明,在克隆培养过程中在体外积累的突变将由细胞的子集共享。这使得过滤所有体外突变,因为这些将存在于较小的部分读取相比,在体内获得突变9。以前的方法已经利用全基因组扩增(WGA)10从单个细胞中获得了足够的DNA。然而,WGA的主要缺点是其相对容易出错和不平衡的基因组扩增,这可能导致等位基因下降11。然而,由于这种方法依赖于单细胞的体外扩张,它仅限于具有足够复制潜力的血细胞,而WGA依赖方法则并非如此。早先对克隆培养物进行测序的努力依赖于使用进料层来确保单次HSPCs12的克隆扩增。然而,来自进料层的DNA可能会污染克隆培养物的DNA,混淆随后的突变调用和过滤。这里介绍的方法完全依赖于指定的介质来克隆地扩展单个HSPCs,因此避免了DNA污染问题。到目前为止,我们已经成功地将这种方法应用于人类骨髓、脐带血、冷冻骨髓和外周血。
这里介绍的是一种检测单个HSPCs生命期间积累的突变,并使用这些突变数据构建早期发育谱系树的方法。
为了成功执行这些检测,必须满足几个关键要求。首先,必须确保样品的可行性。快速处理样品是确保程序效率的关键。其次,生长因子效力的丧失将对HSPCs的克隆扩张产生负面影响。为了确保高生长因子效力,避免冻融周期和准备一次性等分非常重要。第三,在进行WGS、突变调用和过滤后,验证克隆培养体的克隆性至关重要。为了确认培养体的克隆性,突变的VAF应聚集在一个典型正常样本中的0.5左右(图3)。在突变载荷低的细胞(如脐带血HSPC)中,由于突变数低,很难确定克隆性。
我们的方法依赖于单细胞的体外扩张,以允许WGS。因此,我们的方法仅限于具有克隆扩展的复制潜力的单元格,如 HSPC。在我们手中,大约5%-30%的单排序细胞能够充分膨胀。增长率降低可能导致选择偏差。如前所述,使用WGA的方法可以克服这种选择偏差,因为这种技术不依赖于细胞的扩展。然而,WGA有其自身的缺点,克隆扩增仍然是准确确定全基因组突变数量的唯一方法,没有同音位下降和基因组的相等覆盖,特别是在低真体样本中突变数。
使用这种方法生成的数据可用于确定造血系统的形态,因为在单个细胞中检测到的突变可用于解剖细胞谱系,如图6所示。通常,一个或两个突变可以定义健康捐赠者1中的每个分支。由于世系分支在受孕后早期,定义这些第一个分支的突变也将存在与匹配的正常样本的低VAF,用于过滤生殖系变异1,18,19。在这种情况下,使用非造血细胞(如 MSCs)是首选,因为它们在发育过程中应尽早与造血系统分离。由于T细胞是造血原源,因此使用这些细胞作为匹配的正常样本来过滤生殖系变异可能会混淆发育系谱树最早的分支结构。某些成熟血群中分支特异性突变的亚克隆存在,可以通过靶向深度测序进行测量,这表明该分支的后代可以产生该成熟细胞类型。此外,我们的方法允许评估体内诱变暴露的突变后果,并最终促进白血病的发展。
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了荷兰科学研究组织(NWO)的VIDI赠款(第016.Vidi.171.023)对R.诉B案的支持。
0.20 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
50 mL Syringe, Luer lock | BD | 613-3925 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50G | |
CD11c FITC | BioLegend | 301603 | Clone 3.9 |
CD16 FITC | BioLegend | 302005 | Clone 3G8 |
CD3 BV650 | Biolegend | 300467 | Clone UCHT1 |
CD34 BV421 | BioLegend | 343609 | 561 |
CD38 PE | BioLegend | 303505 | Clone HIT2 |
CD45RA PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 304121 | Clone HI100 |
CD49f PE/Cy7 | BioLegend | 313621 | Clone GoH3 |
CD90 APC | BioLegend | 328113 | Clone 5E10 |
Cell Strainer 5 mL tube | Corning | 352235 | |
CELLSTAR plate, 384w, 130 µL, F-bottom, TC, cover | Greiner | 781182 | |
Cryogenic vial | Corning | 430487 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DMEM/F12 | ThermoFisher | 61965059 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E4884-500G | |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 10500 | |
GlutaMAX | ThermoFisher | 25030081 | |
Human Flt3-Ligand, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-479 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78040.1 | Reconsititute in single-use aliquots (2.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78050.1 | Reconsititute in single-use aliquots (5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human SCF, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human TPO, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-095-752 | Reconsititute in single-use aliquots (12.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Integrative Genomics Viewer 2.4 | Broad Institute | https://software.broadinstitute.org/software/igv/download | |
Iscove's Modified Eagle's Medium | ThermoFisher | 12440061 | |
Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC | BioLegend | 348701 | Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56 |
Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07861 | Used for Density gradient separation |
PBS | Made in at Institute's facility. Commerically available PBS can also be used | ||
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antibiotic formulation |
QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
Qubit 2.0 fluorometer | ThermoFisher | Q32866 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32854 | |
RNAse A | Qiagen | 19101 | |
SH800S Cell Sorter | Sony | SH800S | |
StemSpan SFEM, 500mL | Stem Cell Technologies | 9650 | |
TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA | G-Biosciences | 786-151 | |
TrypLE Express | ThermoFisher | 12605-10 |