Les modèles de mutation somatiques dans les cellules reflètent l’exposition mutagène précédente et peuvent indiquer des relations de lignée développementale. Présenté ici est une méthodologie pour cataloguer et analyser les mutations somatiques dans les cellules hématopoïétiques individuelles de tige et d’ancêtre.
Les cellules hématopoïétiques de tige et d’ancêtre (HSPc) accumulent graduellement des mutations d’ADN pendant une durée de vie, qui peuvent contribuer aux maladies âge-associées telles que la leucémie. Caractériser l’accumulation de mutation peut améliorer la compréhension de l’étiologie des maladies liées à l’âge. Présenté ici est une méthode pour cataloguer les mutations somatiques dans les HSPC individuels, qui est basé sur le séquençage du génome entier (WGS) des cultures cellulaires primaires clonales. Les mutations présentes dans la cellule d’origine sont partagées par toutes les cellules de la culture clonale, tandis que les mutations acquises in vitro après le tri cellulaire sont présentes dans un sous-ensemble de cellules. Par conséquent, cette méthode permet une détection précise des mutations somatiques présentes dans les génomes des HSPC individuels, qui s’accumulent au cours de la vie. Ces catalogues de mutations somatiques peuvent fournir des informations précieuses sur les processus mutationnels actifs dans le tissu hématopoïétique et comment ces processus contribuent à la leukemogénèse. En outre, en évaluant les mutations somatiques qui sont partagées entre plusieurs HSPC de la même lignée individuelle, les relations de lignée clonaque et la dynamique de population des populations sanguines peuvent être déterminées. Comme cette approche repose sur l’expansion in vitro des cellules individuelles, la méthode est limitée aux cellules hématopoïétiques avec un potentiel réplicif suffisant.
L’exposition des cellules hématopoïétiques de tige et d’ancêtre (HSPC) aux sources mutagenic endogènes ou extrinsèques contribue à l’accumulation progressive des mutations dans l’ADN pendant une durée de vie1. L’accumulation graduelle de mutation dans HSPcs1 peut avoir comme conséquence l’hématopoiesis clonal relatif à l’âge (ARCH)2,3, qui est une condition non-symptomatique conduite par HSPcs portant des mutations leucémie-conducteur. Initialement, on pensait que les personnes atteintes d’ARCH ont un risque accru de leucémie2,3. Cependant, des études récentes ont montré une incidence de 95% de arch chez les personnes âgées4, ce qui rend l’association avec les tumeurs malignes moins claire et soulevant la question de savoir pourquoi certaines personnes atteintes d’ARCH finissent par développer ou ne développent pas de tumeurs malignes. Néanmoins, les mutations somatiques dans les HSPC peuvent poser de graves risques pour la santé, car les troubles myélodysplasiques et la leucémie sont caractérisés par la présence de mutations spécifiques du conducteur du cancer.
Pour identifier les processus mutationnels et étudier la clonalité sanguine, l’accumulation de mutation dans les HSPC individuels doit être caractérisée. Les processus mutationnels laissent des modèles caractéristiques dans le génome, ce que l’on appelle les signatures mutationnelles, qui peuvent être identifiés et quantifiés dans des collections de mutations à l’échelle du génome5. Par exemple, l’exposition à la lumière UV, aux agents alkylants et aux défauts des voies de réparation de l’ADN ont été associées à une signature mutationnelle différente6,7. En outre, en raison de la nature stochastique des accumulations de mutation, la plupart (sinon la totalité) des mutations acquises sont uniques entre les cellules. Si des mutations sont partagées entre plusieurs cellules d’un même individu, cela indique que ces cellules partagent un ancêtre commun8. Par conséquent, en évaluant les mutations partagées, les relations de lignée peuvent être déterminées entre les cellules et un arbre de lignée développementale peut être construit branche par branche. Cependant, le catalogage des mutations somatiques rares dans les cellules physiologiquement normales est techniquement provocant en raison de la nature polyclonal des tissus sains.
Présenté ici est une méthode pour identifier et déterminer avec précision les mutations somatiques dans les génomes des HSPC individuels. Cela implique l’isolement et l’expansion clonale des HSPC in vitro. Ces cultures clonales reflètent la composition génétique de la cellule d’origine (c.-à-d. que les mutations de la cellule d’origine seront partagées par toutes les autres cellules de la culture). Cette approche nous permet d’obtenir suffisamment d’ADN pour le séquençage du génome entier (WGS). Nous avons déjà montré que les mutations accumulées in vitro pendant la culture clonale seront partagées par un sous-ensemble de cellules. Cela permet le filtrage de toutes les mutations in vitro, car celles-ci seront présentes dans une plus petite fraction de lectures par rapport aux mutations acquises in vivo9. Les méthodes précédentes ont obtenu suffisamment d’ADN à partir d’une seule cellule pour WGS en utilisant l’amplification du génome entier (WGA)10. Cependant, le principal inconvénient de la WGA est son amplification relativement sujette aux erreurs et déséquilibrée du génome, ce qui peut entraîner des abandons allèle11. Néanmoins, comme cette approche repose sur l’expansion in vitro des cellules individuelles, elle se limite aux cellules sanguines ayant un potentiel réplicif suffisant, ce qui n’est pas le cas pour les méthodes dépendantes de la WGA. Les efforts antérieurs de séquençage des cultures clonales ont compté sur l’utilisation de couches d’alimentation pour assurer l’amplification clonale des HSPC simples12. Cependant, l’ADN des couches d’alimentation peut potentiellement contaminer l’ADN des cultures clonales, confondant l’appel et le filtrage ultérieurs de mutation. La méthode présentée ici repose uniquement sur un moyen précis d’expansion ponctuelle des HSPC uniques, et évite ainsi la question de la contamination par l’ADN. Jusqu’à présent, nous avons appliqué avec succès cette méthode sur la moelle osseuse humaine, le sang de cordon, la moelle osseuse bien gelée et le sang périphérique.
Présenté ici est une méthode pour détecter les mutations qui se sont accumulées au cours de la vie dans les HSPC individuels et de construire un arbre de lignée développementale précoce en utilisant ces données de mutation.
Plusieurs exigences critiques doivent être remplies afin d’effectuer ces essais avec succès. Premièrement, la viabilité de l’échantillon doit être assurée. Une manipulation rapide de l’échantillon est essentielle pour assurer l’efficacité de la procédure. Deuxièmement, la perte de puissance du facteur de croissance aura une incidence négative sur l’expansion clonale des HSPC. Pour assurer une puissance élevée du facteur de croissance, il est important d’éviter les cycles de gel-dégel et de préparer des aliquots à usage unique. Troisièmement, après avoir effectué WGS, appel de mutation et de filtrage, il est crucial de valider la clonalité de la culture clonale. Pour confirmer la clonalité de la culture, le VAF des mutations devrait se regrouper autour de 0,5 dans un échantillon karyotypiquement normal (Figure 3). Dans les cellules à faible charge mutationnelle, comme les HSPC de sang de cordon, il est plus difficile de déterminer la clonalité due aux faibles nombres de mutation.
Notre approche repose sur l’expansion in vitro des cellules individuelles pour permettre le WGS. Par conséquent, notre approche est limitée aux cellules qui ont le potentiel réplicif de se développer de façon clonale, comme les HSPC. Dans nos mains, environ 5%-30% de toutes les cellules à tri unique sont capables de se développer correctement. La réduction des taux de croissance peut entraîner un biais de sélection. Comme nous l’avons vu précédemment, les méthodes utilisant WGA peuvent surmonter ce biais de sélection que cette technique est ne repose pas sur l’expansion des cellules. Cependant, LA WGA a ses propres défauts, et l’amplification clonale reste la seule méthode pour déterminer avec précision le nombre de mutations dans l’ensemble du génome sans abandons alléliques et une couverture égale le long du génome, en particulier dans les échantillons avec peu de somatique vrai numéros de mutation.
Les données générées à l’aide de cette approche peuvent être utilisées pour déterminer les phylogénies du système hématopoïétique, car les mutations détectées dans les cellules individuelles peuvent être utilisées pour disséquer les lignées cellulaires, comme le montre la figure 6. Typiquement, une ou deux mutations peuvent définir chaque branche dans un donneur sain1. Puisque la branche de lignéetôt après la conception, les mutations définissant ces premières branches seront également présentes avec un bas VAF dans l’échantillon normal assorti qui a été employé pour filtrer les variantes de germline1,18,19. Dans ce cas, l’utilisation des cellules non hématopoïétiques, telles que les MSC, sont préférées car on s’attend à ce qu’elles se séparent très tôt pendant le développement du système hématopoïétique. Comme les lymphocytes T sont d’origine hématopoïétique, l’utilisation de ces cellules comme échantillon normal assorti pour filtrer les variantes germinales pourrait donc confondre la construction de la branchement la plus précoce de l’arbre de lignée développementale. La présence sous-clonale de mutations spécifiques aux branches dans certaines populations sanguines matures, qui peuvent être mesurées par un séquençage profond ciblé, indiquera que la progéniture de cette branche peut donner naissance à ce type de cellules matures. En outre, notre approche permet d’évaluer les conséquences mutationnelles de l’exposition mutagène in vivo et, en fin de compte, comment cela peut contribuer au développement de la leucémie.
The authors have nothing to disclose.
Cette étude a été soutenue par une subvention VIDI de l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO) (no. 016.Vidi.171.023) à R. c. B.
0.20 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
50 mL Syringe, Luer lock | BD | 613-3925 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50G | |
CD11c FITC | BioLegend | 301603 | Clone 3.9 |
CD16 FITC | BioLegend | 302005 | Clone 3G8 |
CD3 BV650 | Biolegend | 300467 | Clone UCHT1 |
CD34 BV421 | BioLegend | 343609 | 561 |
CD38 PE | BioLegend | 303505 | Clone HIT2 |
CD45RA PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 304121 | Clone HI100 |
CD49f PE/Cy7 | BioLegend | 313621 | Clone GoH3 |
CD90 APC | BioLegend | 328113 | Clone 5E10 |
Cell Strainer 5 mL tube | Corning | 352235 | |
CELLSTAR plate, 384w, 130 µL, F-bottom, TC, cover | Greiner | 781182 | |
Cryogenic vial | Corning | 430487 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DMEM/F12 | ThermoFisher | 61965059 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E4884-500G | |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 10500 | |
GlutaMAX | ThermoFisher | 25030081 | |
Human Flt3-Ligand, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-479 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78040.1 | Reconsititute in single-use aliquots (2.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78050.1 | Reconsititute in single-use aliquots (5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human SCF, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human TPO, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-095-752 | Reconsititute in single-use aliquots (12.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Integrative Genomics Viewer 2.4 | Broad Institute | https://software.broadinstitute.org/software/igv/download | |
Iscove's Modified Eagle's Medium | ThermoFisher | 12440061 | |
Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC | BioLegend | 348701 | Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56 |
Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07861 | Used for Density gradient separation |
PBS | Made in at Institute's facility. Commerically available PBS can also be used | ||
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antibiotic formulation |
QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
Qubit 2.0 fluorometer | ThermoFisher | Q32866 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32854 | |
RNAse A | Qiagen | 19101 | |
SH800S Cell Sorter | Sony | SH800S | |
StemSpan SFEM, 500mL | Stem Cell Technologies | 9650 | |
TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA | G-Biosciences | 786-151 | |
TrypLE Express | ThermoFisher | 12605-10 |