דפוסי המוטציה הסומטיים בתאים משקפים חשיפה מוטרית קודמת ויכולים לחשוף קשרים התפתחותיים של השושלת. המוצג כאן הוא מתודולוגיה לקטלג ולנתח מוטציות סומטיות בתאי גזע ומחולל המטפאות בודדים.
גזע המטפאות ומחולל הזרע (HSPCs) בהדרגה לצבור מוטציות DNA במהלך תוחלת חיים, אשר יכול לתרום לגיל הקשורים מחלות כגון לוקמיה. אפיון הצטברות מוטציה יכול לשפר את ההבנה של האטיולוגיה של מחלות הקשורות לגיל. הציגו כאן היא שיטה לקטלג מוטציות סומטיים ב-HSPCs הפרט, אשר מבוסס על רצף הגנום השלם (WGS) של תרביות תאים שבטיים הראשי. מוטציות הקיימות בתא המקורי משותפות על ידי כל התאים בתרבות המשובטים, בעוד מוטציות שנרכשו בחוץ לאחר מיון התא נמצאים בקבוצת משנה של תאים. לכן, שיטה זו מאפשרת זיהוי מדויק של מוטציות סומטיים נוכח הגנום של HSPCs הפרט, אשר מצטברים במהלך החיים. הקטלוגים הללו של מוטציות סומטיים יכולים לספק תובנות יקרות לתהליכי ממוגרפיה הפעילים ברקמות המטפאות וכיצד תהליכים אלה תורמים ללוקבגנזה. בנוסף, על ידי הערכת מוטציות סומטיים המשותפים בין HSPCs מרובים של אותו אדם, יחסי השושלת השיבטיים והדינמיקה האוכלוסין של אוכלוסיות דם ניתן לקבוע. כאשר גישה זו נשענת על התרחבות מבחנה של תאים בודדים, השיטה מוגבלת לתאים המטבטיים עם פוטנציאל replicative מספיק.
חשיפת תאים גזע המטפאות ומחולל קדמון (HSPCs) כדי אנדודוגני או מקורות מוטאריים חיצוניים תורמת להצטברות הדרגתית של מוטציות ב-DNA במהלך תוחלת חיים1. הצטברות מוטציה הדרגתית ב hspcs1 יכול לגרום לגיל שבטיים הקשור המטפיאה (ARCH)2,3, שהוא מצב שאינו סימפטומטי מונע על ידי הנושאים hspcs נושאת לוקמיה-מוטציות הנהג. בתחילה, הוא חשב כי אנשים עם קשת יש סיכון מוגבר עבור לוקמיה2,3. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו שכיחות של 95% של קשת באנשים קשישים4, מה שהופך את הקשר עם ממאירות פחות ברור להעלות את השאלה למה אנשים מסוימים עם ARCH בסופו של דבר לעשות או לא לפתח ממאירות. עם זאת, מוטציות סומטיים ב HSPCs יכול להוות סיכונים בריאותיים רציניים, כמו הפרעות מיאלואידית ולוקמיה מאופיינים על ידי נוכחות של מוטציות ספציפיות של מנהלי התקן סרטן.
כדי לזהות את תהליכי הזיהוי והקלאליות של דם לימוד, הצטברות מוטציה ב-HSPCs הפרט צריך להיות מאופיין. תהליכי הדפוס משאירים דפוסים אופייניים בגנום, כביכול חתימות מודמות, שניתן לזהות ולכמת באוספי הגנום הרחב של מוטציות5. למשל, חשיפה לאור אולטרא סגול, סוכני al, ופגמים במסלולי תיקון DNA יש כל אחד נקשר עם חתימת מוסיקה שונה6,7. בנוסף, בשל האופי הסטוכסטי של צטברויות מוטציה, רוב (אם לא כולם) של המוטציות הנרכשים הם ייחודיים בין התאים. אם מוטציות משותפות בין תאים מרובים של אותו אדם, הוא מציין כי תאים אלה חולקים אבקדמון משותף. לכן, על-ידי הערכת מוטציות משותפות, ניתן לקבוע קשרי שושלת היוחסין בין תאים לבין עץ השושלת ההתפתחותי ניתן לבנות ענף בענף. עם זאת, קיטלוג מוטציות סומאליות נדירות בתאים מבחינה פיזיולוגית הוא מאתגר באופן טכני בשל הטבע polyclonal בטים של רקמות בריאות.
המוצג כאן הוא שיטה לזהות במדויק ולקבוע מוטציות סומטיים בתוך הגנום של HSPCs הפרט. זה כולל את הבידוד ואת התפשטות המשובטים של HSPCs ב מבחנה. תרבויות אלה שבטים לשקף את האיפור הגנטי של התא המקורי (כלומר, מוטציות בתא המקורי יהיה משותף על ידי כל התאים האחרים בתרבות). גישה זו מאפשרת לנו להשיג די. אן. איי עבור רצף הגנום השלם (WGS). הצגנו בעבר כי מוטציות שהצטברו בתוך מבחנה במהלך תרבות שבטיים ישותפו על ידי קבוצת משנה של תאים. זה מאפשר סינון של כל מוטציות חוץ גופית, כמו אלה יהיה נוכח חלק קטן יותר של קריאות לעומת vivo רכשה מוטציות9. שיטות קודמות השיגו די. אן. איי מתא אחד עבור WGS באמצעות הגברה שלמה של הגנום (WGA)10. עם זאת, החיסרון העיקרי של WGA הוא הגברה שגיאה יחסית מועדת ובלתי מאוזנת של הגנום, אשר יכול לגרום לאלה מתלהבים האלה11. עם זאת, כאשר גישה זו מסתמכת על התרחבות מבחנה של תאים בודדים, היא מוגבלת לתאי דם עם פוטנציאל replicative שאינו המקרה עבור שיטות התלויות ב-WGA. מאמצים קודמים ברצף תרבויות המשובטים הסתמך על שימוש בשכבות ממזין כדי להבטיח הגברה של השבטים של HSPCs12. עם זאת, ה-DNA מן השכבות ממזין יכול לזהם את ה-DNA של תרבויות המשובטים, הקמת הקורא מוטציה לאחר מכן סינון. השיטה המוצגת כאן מסתמכת אך ורק על בינוני שצוין כדי clonally להרחיב HSPCs בודד, ולכן נמנע את הנושא של זיהום DNA. עד עכשיו, יש לנו בהצלחה להחיל את השיטה הזאת על מח עצם אנושי, דם טבורי, מח עצם קפוא למדי, דם היקפי.
מוצג כאן היא שיטה לזהות מוטציות שהצטברו במהלך החיים HSPCs הפרט לבנות עץ השושלת התפתחותית מוקדם באמצעות נתונים אלה מוטציה.
יש להכיר מספר דרישות קריטיות כדי לבצע בהצלחה את התנאים הבאים. ראשית, יש להבטיח את הכדאיות של המדגם. טיפול מהיר של המדגם הוא המפתח כדי להבטיח את יעילות ההליך. שנית, אובדן העוצמה של גורם הגדילה ישפיע לרעה על התפשטות השבטים של HSPCs. כדי להבטיח עוצמת גידול גבוהה הצמיחה, חשוב למנוע הקפאת ההפשרה מחזורים ולהכין מחזורי שימוש יחיד. שלישית, לאחר ביצוע WGS, קורא מוטציה וסינון, זה חיוני כדי לאמת את הclonality של תרבות המשובטים. כדי לאשר את הclonality של התרבות, VAF של המוטציות צריך אשכול סביב 0.5 ב karyotypically דרך כלל מדגם רגיל (איור 3). בתאים עם עומס מיתר נמוך, כגון HSPCs דם טבורי, קשה יותר לקבוע הclonality בשל מספרים מוטציה נמוכה.
הגישה שלנו מסתמכת על התרחבות מבחנה של תאים בודדים כדי לאפשר WGS. לכן, הגישה שלנו מוגבלת לתאים בעלי הפוטנציאל הclonally להתרחב, כגון HSPCs. בידינו, כ-5%-30% מכלל התאים הממוינים בודדים מסוגלים להתרחב כראוי. שיעורי גדילה מופחתים עלולים לגרום להטיה בחירה. כפי שהוזכר קודם לכן, שיטות המשתמשות ב-WGA יכולות להתגבר על הטיית בחירה זו, כאשר טכניקה זו אינה נשענת על התרחבות התאים. עם זאת, WGA יש חסרונות משלו, והגברה שבטיים נשאר השיטה היחידה כדי לקבוע במדויק את מספר המוטציות בגנום כולו ללא allelic מתלהבים וכיסוי שווה לאורך הגנום, במיוחד בדגימות עם סומאטיק אמיתי נמוך . מספרי מוטציה
הנתונים שנוצרו באמצעות גישה זו ניתן להשתמש כדי לקבוע phylogenies של המערכת המטטית, כמו המוטציות שזוהו בתאים בודדים ניתן להשתמש כדי לנתח את התאים בזמן, כפי שמתואר באיור 6. בדרך כלל, מוטציות אחת או שתיים יכולות להגדיר כל ענף בתורם בריא1. מאז הענף ליננות מוקדם לאחר ההתעברות, מוטציות המגדירות ענפים אלה הראשון יהיה גם נוכח vaf נמוכה במדגם רגיל בהתאמה ששימש לסינון משתני germline1,18,19. במקרה זה, השימוש בתאים שאינם המטבטיים, כגון MSCs, הם מועדפים כפי שהם צפויים להפריד מוקדם מאוד במהלך הפיתוח של המערכת המטתית. כמו T-תאים הם של מוצא המטמית, השימוש בתאים אלה כמדגם נורמלי תואם לסנן משתני germline יכול אפוא לבלבל את הבנייה של הסתעפות המוקדם בעץ השושלת ההתפתחותית. נוכחות תת-שבטיים של מוטציות ספציפיות לענף באוכלוסיות דם בוגרות מסוימות, אשר ניתן למדוד על ידי רצף ממוקד עמוק, יציין כי צאצאי הענף הזה יכול להצמיח את סוג התא הבוגר. בנוסף, הגישה שלנו מאפשרת להעריך את ההשלכות המוטלות של חשיפה מוטרית בvivo ובסופו של דבר כיצד זה עשוי לתרום להתפתחות לוקמיה.
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה היה נתמך על ידי מענק VIDI של הארגון הולנד למחקר מדעי (NWO) (no 016. Vidi. 171.023) כדי R. v. B.
0.20 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
50 mL Syringe, Luer lock | BD | 613-3925 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50G | |
CD11c FITC | BioLegend | 301603 | Clone 3.9 |
CD16 FITC | BioLegend | 302005 | Clone 3G8 |
CD3 BV650 | Biolegend | 300467 | Clone UCHT1 |
CD34 BV421 | BioLegend | 343609 | 561 |
CD38 PE | BioLegend | 303505 | Clone HIT2 |
CD45RA PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 304121 | Clone HI100 |
CD49f PE/Cy7 | BioLegend | 313621 | Clone GoH3 |
CD90 APC | BioLegend | 328113 | Clone 5E10 |
Cell Strainer 5 mL tube | Corning | 352235 | |
CELLSTAR plate, 384w, 130 µL, F-bottom, TC, cover | Greiner | 781182 | |
Cryogenic vial | Corning | 430487 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DMEM/F12 | ThermoFisher | 61965059 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E4884-500G | |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 10500 | |
GlutaMAX | ThermoFisher | 25030081 | |
Human Flt3-Ligand, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-479 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human Recombinant IL-3 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78040.1 | Reconsititute in single-use aliquots (2.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human Recombinant IL-6 (E. coli-expressed) | Stem Cell Technologies | 78050.1 | Reconsititute in single-use aliquots (5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human SCF, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Reconsititute in single-use aliquots (25 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Human TPO, premium grade | Miltenyi Biotech | 130-095-752 | Reconsititute in single-use aliquots (12.5 μL) at 100 μg/mL in 0.1% BSA in PBS |
Integrative Genomics Viewer 2.4 | Broad Institute | https://software.broadinstitute.org/software/igv/download | |
Iscove's Modified Eagle's Medium | ThermoFisher | 12440061 | |
Lineage (CD3/14/19/20/56) FITC | BioLegend | 348701 | Clones: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56 |
Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07861 | Used for Density gradient separation |
PBS | Made in at Institute's facility. Commerically available PBS can also be used | ||
Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antibiotic formulation |
QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
Qubit 2.0 fluorometer | ThermoFisher | Q32866 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32854 | |
RNAse A | Qiagen | 19101 | |
SH800S Cell Sorter | Sony | SH800S | |
StemSpan SFEM, 500mL | Stem Cell Technologies | 9650 | |
TE BUFFER PH 8.0, LOW EDTA | G-Biosciences | 786-151 | |
TrypLE Express | ThermoFisher | 12605-10 |