Caracterizando a carga mutacional e a composição clonal do sangue humano

As amostras devem ser obtidas de acordo com os protocolos de ética apropriados, e os doadores devem dar o consentimento informado antes do procedimento. 1. preparação do material da amostra Nota: Ao trabalhar com material recém-obtido, comece com a etapa 1,1. Ao trabalhar com material congelado, comece com a etapa 1,2. Preparando a medula óssea fresca, sangue do cordão umbilical ou sangue periférico Isole a fração mononucleares da amostra usando a separação de gradiente de densidade seguindo as instruções dos fabricantes (ver tabela de materiais) e conte as células mononucleares usando um hemociômetro. Após o isolamento das células mononucleares, continue com a etapa 1,3. OPCIONAL: o número recomendado de células necessárias para ordenar uma placa 384 bem completa de HSPCs é 1 – 2 x 107. Se mais células forem isoladas durante a centrifugação de gradiente de densidade, armazene o excedente de células em nitrogênio líquido. Reressuscitem as células em 500 μL de IMDM + 10% FBS por 1 x 107 células, e adicionar gota-a-gota um volume igual de imdm + 30% FBS + 20% DMSO para conseguir uma suspensão de 1 x 107 células em 1 ml de IMDM + 20% FBS + 10% DMSO. Transfira imediatamente as células mononucleares para 1 mL de frascos criogênicos e congele as células a-80 ° c em um recipiente de congelamento de células de taxa controlada durante a noite. Transfira as células no dia seguinte para um armazenamento de nitrogênio líquido após o processamento. Preparando células mononucleares congeladas da medula óssea, sangue do cordão umbilical ou sangue periférico Prepare 50 mL de meio de descongelar células contendo 45 mL de Iscove ‘ s Modified Eagle ‘ s Medium (IMDM) e 5 mL de soro bovino fetal (FBS) e aqueça em banho de água de 37 ° c. Tome o frasco contendo a amostra do armazenamento do nitrogênio líquido, transfira a amostra para o gelo seco, e descongele o mais rapidamente possível em um banho de água de 37 ° c. Quando a amostra é quase descongelada, limpe o frasco com 70% de etanol e transfira o seu conteúdo para um tubo cônico de 50 mL. Enxague o frasco com 1 ml de imdm pré-aquecido + 10% de FBS para recolher as restantes células e adicione esta solução gota gota (5 s por gota) à amostra descongelada enquanto roda suavemente o tubo. Adicionar um adicional pré-aquecido 15 ml de imdm + 10% FBS gota gota para a amostra, enquanto girando suavemente o tubo. Pellet as células por centrifugação por 5 min em 350 x g. Remover todos, mas ± 3 mL do sobrenadante. Ressuscitar as células no sobrenadante remanescente e diluir adicionando 20 mL de IMDM + 10% FBS drop-by-drop enquanto agitando suavemente o tubo. Tome 10 μL da suspensão celular para contagem de células. Diluir estes 10 μL adicionando 20 μL de solução de 0,4% de azul de Tripan e contar as células utilizando um hemociômetro. O número da célula pode diminuir após o descongelar, com até 50% de perda de células após a thawing. A viabilidade celular deve variar entre 70% e 90%. Se trabalhar com medula óssea ou células sanguíneas do cordão umbilical, pegue 5 x 106 células mononucleares para cultura MSC (etapa 2,1). Se estiver a trabalhar com sangue periférico, tome 2 – 5 x 106 células para isolamento de células T (passo 2,2) Células remanescentes da pelota 5 min a 350 x g e ressuscitem em 3 ml de tampão FACS (0, 5% BSA + 1 mm EDTA em PBS). Transferir 1 x 105 células para um microtubo preenchido com 200 μL de tampão FACS, que servirá como um controle negativo para a citometria de fluxo (passo 3,8), e manter no gelo. 2. cultura de células Nota: Para obter catálogos de mutações adquiridas somaticamente, a variação do germline doador-específico precisa de ser filtrada para fora. Ao começar com biópsias de medula óssea ou sangue do cordão umbilical, as células estromais mesenquimais (MSCs) podem ser usadas como controle correspondente para filtrar a variação da linha germinal. Neste caso, siga a seção 2,1. Ao usar o sangue periférico (mobilizado) siga o passo 2,2 para isolar e usar células T como amostra de controle correspondente para filtrar a variação da linha germinal (Figura 1). A população de células T em massa compartilhará a mesma relação de linhagem que os HSPCs. Cultura MSC Prepare 50 mL de meio MSC contendo 45 mL de meio DMEM/F12, 10% FBS, 500 μL de tripsina ou tripsina alternativa, e 500 μL de solução de penicilina/estreptomicina. Placa de aproximadamente 5 x 105 células mononucleares em 1,5 ml de meio MSC por poço. Coloc as pilhas em uma incubadora humidificada em 37 ° c com 5% CO2. Substitua o meio após 24 h, e substitua subseqüentemente o meio cada 3 dias para assegurar-se de que todas as pilhas hematopoietic estejam lavadas fora. Continue até a cultura até que a confluência seja 100%. Se os MSCs forem confluentes, lave as células com 1 mL de PBS e colha os MSCs adicionando 200 μL de tripsina ou tripsina alternativa por poço. Incubar células por 5 min a 37 ° c. Adicione 800 μL de meio MSC e Pipet as células para cima e para baixo para soltar as células da placa de poço. Transfira MSCs ao tubo do microcentrifugador e pellet as pilhas pela centrifugação por 5 minutos em 350 x g. Retire o sobrenadante e continue com o isolamento do ADN ou guarde a pelota a-20 ° c para um isolamento posterior do ADN (secção 4). Isolamento de células TNota: Se estiver usando sangue periférico (mobilizado), as células T podem ser isoladas e usadas como controle de germline. Ressuspender o pellet celular em 100 μL de solução de coloração anti-CD3 (1:100 diluição do anticorpo anti-CD no tampão FACS). Lave as células adicionando 1 mL de tampão FACS. Pellet as células por centrifugação por 5 min a 350 x g e ressuscitem em 300 μL de tampão FACS. Isolar pelo menos 5 x 105 células CD3 + usando um FACS-classificador em um tubo de poliestireno de 5 ml pré-preenchido com 1 ml de FBS. Pellet as células classificadas usando centrifugação por 5 min em 350 x g, retire o sobrenadante, e continuar diretamente com isolamento de DNA (seção 4) ou armazenar o pellet em-20 ° c para posterior isolamento de DNA. 3. isolamento, classificação e cultura do HSPC Gire para baixo em 1 – 2 x 107 células mononucleares por 5 min a 350 x g e ressuscite em 50 ΜL de tampão FACS (ver passo 2.2.1). Transfira as células para um tubo de microcentrífuga.Nota: Ao classificar com > 2 x 107 células, aumente a mistura de anticorpos e os volumes de buffer FACS de acordo. Prepare 50 μL de mistura de coloração de 2x HSC de acordo com a receita observada na tabela 1. Anticorpo volume [μL] BV421-CD34 5 FITC-linhagem Mix (CD3/14/19/20/56) 5 PE-CD38 2 APC-CD90 0,5 PerCP/Cy 5.5-CD45RA 5 PE/Cy7-CD49f 1 FITC-CD16 1 FITC-CD11 5 Tampão de FACS 25,5 Tabela 1: mistura de classificação de HSC. Mostrado é uma tabela que indica as diluições dos anticorpos usados para classificar os HSCs. Misturar 50 μL de solução celular com a mistura de coloração HSC preparada e incubar as células durante 15 min à temperatura ambiente (RT) ou por 1 h no gelo para que os anticorpos se liguem. Lave as células adicionando 1 mL de tampão FACS e pellet por centrifugação por 5 min a 350 x g. Ressuspender as células em 300 μL de tampão FACS e filtrar a suspensão celular através de um tubo de poliestireno de 5 mL com filtro de célula de 35 μm para remover os aglomerados celulares antes da triagem de células ativadas por fluorescência (FACS). Prepare 25 mL de meio de cultura HSPC, consistindo de 1x SFEM médio suplementado com 100 ng/mL SCF, 100 ng/mL Flt3, 50 ng/mL TPO, 10 ng/mL IL-3, 20 ng/mL IL-6, e 100 ng/mL formulação antibiótica (ver tabela de materiais). Encha uma placa da cultura da pilha de 384 poços com 75 μL do meio de cultura de HSPC em cada poço.Nota: Para evitar a evaporação do meio nos poços exteriores, encha os poços exteriores com 75 μL de água estéril ou PBS, e não utilize estes poços para a triagem celular. Classificando os HSPCs únicos Definir portões para a classificação de HSPC com base em um controle não manchado (etapa 1,9) e 10.000 células da amostra manchada. Um resultado representativo para A configuração de portões é representado na Figura 1. Porta células únicas desenhando uma porta ao redor da fração linear FSC-Height vs. FSC-Area. Use a fração de controle não manchada para desenhar a porta para linhagem- fração. Desenhe portões para células CD34+ e caracterize ainda mais este subconjunto definindo um portão específico para CD38- CD45RA- Cells. Carregue a placa 384 bem na máquina FACS e classifique as únicas células.Nota: Se aplicável ao FACS-Machine, alterne a opção para manter os dados de classificação do índice para habilitar o rerastreamento das células classificadas. Cultivando HSCs classificados isoladamente Transfira diretamente a placa de 384 poços para uma incubadora humidificada de 37 ° c com 5% de CO2.Nota: Para impedir a evaporação durante a cultura, enrole a placa da cultura do poço 384 (com tampa) no envoltório transparente do polietileno. Mantenha a placa 384 bem na incubadora por 3 – 4 semanas até que apareçam clones visíveis. As imagens representativas da cultura clonal são representadas na Figura 2. Com base na condição do material de entrada 5% – 30% das células classificadas irão clonalmente expandir. 4. colheita de clones de HSPC Após 4 semanas de cultivo, determinar quais os poços têm uma confluência de 30% ou superior. Pré-preenchimento (para cada outgrowth clonal) 1,5 mL microtubos com 1 mL de BSA 1% em PBS e rotular o tubo de acordo com o poço correspondente. Pré-molhe uma ponta de pipeta com 1% de BSA em PBS para minimizar o número de células aderindo à ponta da pipeta. Pipet para cima/para baixo o meio no poço ferozmente (pelo menos 5 vezes) com uma pipeta de 200 μl (ajustada em 75 μL) e raspe a parte inferior do poço para afrouxar pilhas no poço, e para recolher a suspensão da pilha no microtubo etiquetado que corresponde ao poço. Tome acima 75 μL de BSA fresco de 1% em PBS e repita a pipetagem no poço para assegurar a captação máxima das pilhas.Nota: As pilhas clonally cultivadas podem furar à parte inferior do poço. Inspecione os poços usando um microscópio de luz invertido padrão para garantir se todas as células foram coletadas. Se todos os poços com > 30% confluência foram colhidas, coloque o 384 bem placa de volta na incubadora. As culturas clonais podem proliferar por até 5 semanas. Gire para baixo a suspensão da pilha por 5 minutos em 350 x g. Um pequeno pellet deve ser visível. Retire cuidadosamente todos, mas cerca de 5 μL de sobrenadante. As pelotas da pilha podem ser congeladas em-20 ° c e armazenadas por meses múltiplos antes do isolamento do ADN. 5. isolação do ADN Isole o DNA de HSPC e MSC/célula T usando um kit de isolamento de DNA de microescala de acordo com a instrução do fabricante com os seguintes ajustes: Adicionar 2 μL de RNase A após adição de tampão AL durante A secção 2. Incubar por 2 min antes de adicionar proteinase K. Incubar por 30 min a 56 ° c em vez de 10 min. Elute o DNA carregando a coluna com 50 μL do tampão de TE com baixo EDTA (Tris de 10 milímetros, EDTA de 0,1 milímetros). Para a eluição óptima, recarregue o evate outra vez na coluna e gire-o outra vez. Determine a concentração de DNA usando um DNA medindo 2 μL por clone. O rendimento do DNA normalmente varia entre 0,5 – 3 ng/μL. 6. sequenciamento Executar sequenciamento de DNA conforme descrito por Jager et al.13 7. mapeamento e chamada de mutação somática Mapeie a saída do sequenciamento (arquivos FASTQ) para o genoma de referência e mutações de chamada, conforme descrito em Jager et al.13 Inspecione os dados para alterações cariotípicas aberrantes em clones seqüenciados e dados em massa usando uma ferramenta de análise de número de cópia, como Control-FreeC14. Até agora, nós não relataram nenhuns HSPCs com aberrâncias karyotypic. Gere uma lista negra, que consiste em um painel de amostras normais sem correspondência para fins de filtragem de um próprio conjunto de amostras, conforme descrito anteriormente13, ou use a seguinte lista negra carregada: . Filtre as variações de nucleotídeo único usando SNVFI . Arquivo SNVFI. config predefinido, de forma que todos os caminhos para funções auxiliares estão corretos. Execute o arquivo SNVFI com. ini configurado de acordo com as configurações vistas no arquivo suplementar 1 (snvfi. ini). Para excluir mutações in vitro induzidas, filtramos para uma VAF ≥ 0,39. Verifique a saída da fração de alelo variante (VAF) do SNVFI (Figura 4). Verifique se o pico do gráfico de densidade está perto de 0,5, indicando que a amostra é clonal. Opcional: Para determinar a parte do genoma que é coberta durante a filtração, determine as regiões callable ao longo do germline e controle usando CallableLoci de GATK (ToolKit da análise do genoma):Java-jar GenomeAnalysisTK. jar \ \-T CallableLoci \-R referência. FASTA \ \-Eu myreads. bam \ \-Sumário Table. txt \-o callable_status. Bed Opcional: Recupere as regiões callable da saída de CallableLoci e realize intersecções emparelhadas entre os exemplos e o volume usando o script Python CallableLoci_processor. py presente em https://github.com/ToolsVanBox/CallableLoci_processor . Os arquivos de leito resultantes podem ser usados para filtrar ainda mais a saída do SNVFI e para inspecionar o perfil mutacional na seção 9:CallableLoci_processor. py dir_in dir_out sample_name bulk_name – amostras Sample1 Sample2 sample3 8. Indel Calling Selecione todas as inserções e exclusões (indels) no arquivo raw_variants. vcf usando GATK SelectVariants:Java-Xmx12G \-jar GenomeAnalysisTK. jar \ \-T SelectVariants \-R reference_genome. FASTA \-V raw_variants. vcf \-o raw_INDELs. vcf \-selectType INDEL Filtrar raw_INDELS. vcf lista usando INDELFI . com/toolsvanbox/indelfi:Perl INDELFI.pl-i Input. vcf (da etapa 8,1) \-s coluna amostra de teste \-c amostra de controle de coluna 9. inspeção de perfil mutacional Use os arquivos. vcf resultantes da saída SNVFI da etapa 7,6 (ou da etapa 7,9 com a análise opcional de loci callable) para analisar o perfil mutacional genômica, tipos de mutação e análise de assinatura usando o pacote R MutationalPatterns15: . Para a saída representativa que pode ser produzida com o arquivo. vcf resultante, como um espectro mutacional 96-trinucleotídeo, consulte a Figura 5. 10. construção de uma árvore de linhagem de desenvolvimento usando substituições de base Para construir uma árvore de linhagem de desenvolvimento, detecte mutações compartilhadas entre clones. As mutações presentes nos primeiros ramos da árvore de linhagem também podem ser subclonalmente presentes na amostra em massa (MSCs/T-Cells). Linhagens de ramificação posteriores serão definidas por mutações compartilhadas apenas por clones de HSPC. Para identificar mutações que estão presentes em um subconjunto dos clones e subclonalmente presentes em massa, execute as etapas a seguir. Para filtrar mutações somáticas compartilhadas entre clones, execute o script filterSomatic.py em um terminal baseado em UNIX. O script pode ser encontrado em https://github.com/ToolsVanBox/filterSomatic. Antes de executar esse script, edite o arquivo Filtersomática. ini (consulte o arquivo suplementar 2) para definir os caminhos e ajustar os outros parâmetros. Execute filterSomatic.py (python3 filterSomatic.py-i Filtersomática. ini). Filtre para as mutações que são subclonally atuais no volume usando o Determine_lowVAF_bulk. Script R em um terminal baseado em UNIX. O script pode ser encontrado em https://github.com/ToolsVanBox/Identify_lowVAF_bulk_muts. Isso gerará arquivos. vcf separados para SNVs compartilhados e exclusivos:RSCRIPT Determine_lowVAF_bulk. R–vcf caminho/para/Filter_somatic_output. vcf–Bulk bulk_name–sample_name Sample-nome–sexo [M | F–out_dir out_dir Determine todas as mutações compartilhadas entre clones que não estão presentes na amostra em massa, sobrepondo todas as posições de mutação (concatenar a coluna 1 e 2 da saída SNVFI). Exclua falsos positivos obtidos durante as etapas 10,5 e 10,6 por inspeção manual usando IGV16. As mutações são consideradas falsas quando não presentes, quando a mutação está presente no germline ou quando presentes em regiões mal mapeadas, veja a Figura 7.Nota: É altamente recomendável resequenciar todos os loci compartilhados de forma independente usando sequenciamento direcionado ou Sanger. Use as mutações compartilhadas obtidas durante os passos 10,1 e 10,2 para construir uma tabela binária de mutações versus clones seqüenciados, com 0 indicando que a mutação não está presente e 1 indicando a presença da mutação. Output a tabela binária da mutação como em um heatmap junto com um dendrograma que indica relações da linhagem entre pilhas usando R. O heatmap indica o status de mutações para cada célula. Veja a saída desta função (Figura 6).         Clones <-Read. Table ("caminho/para/BinaryTable")         my_palette <-colorRampPalette (c ("#cccccc", "#333333")) (n = 2)col_breaks <-c (0, 0,5, 1)         heatmap. 2 (clone, distfun = função (x) dist (x, method = ‘ binary ‘),hclustfun = função (x) hclust (x, Method = média),dendrograma = “coluna”, Rowv = F,Col = my_palette, Breaks = col_breaks,Trace = “None”, density. info = “None”)