Мы представляем протокол для динамических измерений поверхности дыхательных путей жидкого рН в условиях тонкой пленки с помощью плиты-читателя.
В последние годы важность слизистой поверхности рН в дыхательных путях была подчеркнута его способностью регулировать гидратацию поверхности дыхательных путей (ASL), вязкость слизи и активность антимикробных пептидов, ключевые параметры, связанные с врожденной защитой легких. Это имеет первостепенное значение в области хронических респираторных заболеваний, таких как муковисцидоз (КФ), где эти параметры дисрегулируются. В то время как различные группы изучали ASL pH как in vivo, так и in vitro, их методы сообщают об относительно широком диапазоне значений ASL pH и даже противоречивых выводах относительно любых различий рН между клетками, не относящимися к CF и CF. Кроме того, их протоколы не всегда предоставляют достаточно деталей для обеспечения воспроизводимости, большинство из них имеют низкую пропускную выгоду и требуют дорогостоящего оборудования или специализированных знаний для реализации, что затрудняет их создание в большинстве лабораторий. Здесь мы описываем полуавтоматический флуоресцентный анализ считывателя пластин, который позволяет в режиме реального времени измерения ASL pH в условиях тонкой пленки, которые больше напоминают ситуацию in vivo. Этот метод позволяет для стабильных измерений в течение многих часов из нескольких культур дыхательных путей одновременно и, что важно, динамические изменения в ASL рН в ответ на агонистов и ингибиторы могут контролироваться. Для достижения этой цели, ASL полностью дифференцированных первичных человеческих эпителиальных клеток дыхательных путей (hAECs) окрашены на ночь с рН-чувствительный краситель для того, чтобы для повторного абсорбции избыточной жидкости для обеспечения тонкой пленки условиях. После флуоресценции контролируется в присутствии или отсутствии агонистов, калибровка рН выполняется на месте, чтобы исправить для объема и концентрации красителя. Описанный метод обеспечивает необходимые элементы управления, чтобы сделать стабильные и воспроизводимые измерения ASL pH, которые в конечном итоге могут быть использованы в качестве платформы обнаружения наркотиков для персонализированной медицины, а также адаптированы к другим эпителиальным тканям и экспериментальным состояний, таких как воспалительные и/или модели хоста-патогена.
Эпителий дыхательных путей покрыт тонким (10 мкм) слоем жидкости, который называют поверхностной жидкостью дыхательных путей (ASL). Состав и глубина (гидратация) этого ASL жестко регулируется и контролирует эффективность очистки дыхательныхпутей смуцилерным эскалатором 1,2,3,4. В последние годы, важность ASL H /HCO3– содержание было продемонстрировано различными группами из-за его способности регулировать ASL гидратации5, воспаление дыхательных путей6 и инфекции7, 8, а также вязкость слизи 8,9. Важно отметить, что, хотя существует несколько споров, многие исследования сообщили о дисрегуляции рН дыхательных путей при хронических заболеваниях дыхательных путей, таких как астма10,11,12, ХОБЛ11, бронхиэктаз11, хронический риносинусит13,14 и муковисцидоз (CF)5,9,15,16,17, который предполагает, что методы лечения, которые восстанавливают ASL рН может быть полезным для лечения нескольких типов хронических заболеваний дыхательных путей. CF является наиболее распространенным аутосомно-рецессивным генетическим заболеванием в кавказских популяциях и связано с мутациями в гене регулятора трансмембранной проводимости CF (CFTR). Этот ген кодирует анион (HCO3– и Cl–) канал, который играет решающую роль в ионно-жидком транспорте и гомеостазе через эпителию18. Хотя CF является мультиорганной болезнью, патология легких является основной причиной заболеваемости и смертности19,20 и с учетом первичного дефекта в CF является нарушением транспортировки Cl– и HCO3–, можно предположить, что внеклеточная жидкость рН у людей с CF будет дисрегулируемым по сравнению с людьми, которые не имеют CF. Таким образом, измерение ASL рН была актуальной области исследований CF и различные группы разработали методы для измерения ASL pH в CF дыхательных путей.
In vivo, рН дыхательных путей был измерен с использованием различных методов, от микро-зондов (волоконно-оптические, золотые или мобидиевые зонды)5,21,22,23,24 до рН измерений ожидаемый материал или выдыхаемый конденсат дыхания (EBC)10,11,12,25,26,27. В области исследований CF, рН в настоящее время широко изучается в связи с его потенциальными клиническими последствиями. Теоретически, делая дыхательные пути более щелочной может увеличить бактериального убийства и улучшить муфтилиарии и гомеостаза дыхательных путей в целом. Тем не менее, исследования in vivo/ex vivo сообщают о широком диапазоне значений рН, и на сегодняшний день результаты не являются окончательными относительно наличия разницы в рН между не-CF и CF дыхательных путей. В начале 2000-х годов, различные группы сообщили рН EBC. В небольных групп, значения рН варьировались от 4,6 до 8,5, но интересно, РН EBC был найден более кислой во время обострений у людей с CF12,27. Совсем недавно, in vivo измерения ASL в человеческих и животных моделей CF сообщили противоречивые результаты16,17,21,22,23, 24 и до сих пор неясно, если CF дыхательные пути являются более кислыми, чем не-CF дыхательных путей.
Как in vivo измерения нижней ASL рН оказалось трудно из-за очень небольшого количества жидкости подкладка дыхательных путей и потенциальное присутствие слизистых плагинов в болезни, многие группы обратились к in vitro эксперименты для измерения ASL рН, в основном с использованием трех различных методологии. Первый подход использует dextran-соединенные клетки-impermeant рН-чувствительные флуоресцентные красители, которые добавляются в качестве сухого порошка, либо непосредственно в ASL или с помощью инертной жидкости называется перфторуглерод (PFC)5,8,16 , 17 Лет , 28 , 29 , 30 год , 31 год , 32. Однако, этот метод обеспечивает мало контроля над точным количеством красителя, который добавляется в культуры и представляет собой риск красителя агрегатов и большие различия в концентрации между образцами и / или экспериментов и даже в рамках одного образца . Он также, как правило, выполняется с конфокическим микроскопом, который ограничивает его применимость и во многих случаях предотвращает детальный мониторинг нескольких образцов и изменения условий записи. Второй метод, используемый для измерения ASL рН является использование рН чувствительных микроэлектродов5,15. Поэтому измерения ASL pH не зависят от концентрации флуоресцентного красителя и должны дать более надежные и воспроизводимые результаты. Тем не менее, этот метод не позволяет для динамических, в режиме реального времени измерения ASL pH, и это не легко сделать несколько показаний в различных условиях. Это также трудоемкий, сложный процесс, который требует специального оборудования (микроэлектродных изготовление/электрофизиологических записывающих устройств) и подготовки к сбору образцов для последующего измерения и калибровки рН. Кроме того, эти два метода также показали некоторые несоответствия в способности производить воспроизводимые результаты, используя pH-чувствительный метод флуоресцентного красителя, Tang et al. сообщили значения 7,35 для не-CF ASL и 7,0 для CF ASL8 в то время как в более последние бумаги из той же группы, ASL рН составил 6,9 и 6,4 для не-CF и CF, соответственно17. Аналогичным образом, микроэлектродов измерений дал значения 6,4 в не-CF ASL и 6,1 в CF ASL в исследовании с 200315 в то время как та же группа сообщила значения 6,7 для не-CF ASL и 6,45 для CF ASL в исследовании с 2013 года5. Наконец, в третьем подходе исследователи добавляют относительно большой объем слабо буферизированного раствора на апикальную (слизистую) поверхность культур, тем самым разрушая условия тонкой пленки и изменяя состав ASL, и потенциально его регулирование. рН затем измеряется либо с помощью рН-чувствительных флуоресцентных красителей33, по методу рН-стат титрации в Ussing камере13,14, или требует разбавленного ASL быть удалены из культур и рН измеряется с помощью рН электрод, анализатор или лакмусовая полоска34. Еще одной трудностью в точном измерении ASL pH является создание стандартной кривой, которая является максимально точной. Действительно, выполняются ли показания с помощью электрода, который будет измерять разницу в электрическом потенциале через смолу или с помощью рН-чувствительных флуоресцентных красителей, оба эти подхода будут затронуты местной микросредой образцов измеряется. Более конкретно, диссоциация постоянной (Kd) красителей может значительно варьироваться в зависимости от температуры, ионной силы, вязкости, а также потенциальных взаимодействий красителя с клеточными компонентами, такими как белки и потенциально слизь.
Для того, чтобы попытаться преодолеть многие из этих технических проблем, а также разработать более динамичный, простой и более высокий метод пропускной способностью, мы создали технику in vitro, которая записывает ASL pH в первичных культурах hAEC с помощью клеточного impermeant pH-чувствительного флуоресцентный краситель в стандартном коммерческом плите-читателя. Метод генерирует воспроизводимые, динамические, полуавтоматические измерения ASL pH полностью дифференцированных 3D-клеточных культур в условиях тонкой пленки. С помощью нескольких колодцев пластины читателя, это полуавтоматический опрос может сделать почти одновременные измерения рН до 24 условий более 12 ч и может контролировать эффект добавления различных агонистов или ингибиторов. В настоящем документе мы подробно описываем методологию и сообщаем репрезентативные результаты в условиях положительного и отрицательного контроля, который подтверждает технику.
Здесь мы предоставляем подробный протокол для динамического измерения ASL рН в первичных эпителиальных клеток дыхательных путей человека. Критические шаги включают смыв слизи с апикальной поверхности клеток, измерение и вычитание фона с использованием тех же параметров, что и в эксперименте, оптимизацию z-позиции и усиление и выполнение калибровки pH situ.
Первый шаг мытья клеток имеет решающее значение, поскольку толстый слой слизи может (i) предотвратить красители от достижения перицилятельного слоя (PCL) и (ii) задержки или предотвратить обнаружение изменений в флуоресценции в ответ на агонистов / ингибиторов. Наш метод был разработан для изучения того, как первичные hAECs модулировали активность HCO3– и Hq транспортеров в ответ на агонистов. Хотя будет интересно исследовать, как изменения в PCL рН связаны с изменениями в слизи рН, дальнейшее развитие этого протокола необходимо, в том числе использование различных молекулярных вес-декстранс для дифференциалов целевой 2 слоев и z-сканов через весь ASL.
Еще одним важным шагом этого протокола является измерение фона. Апикальная поверхность полностью дифференцированной первичной эпителии дыхательных путей редко полностью плоская, которая повлияет на световой путь и, следовательно, фон. Обеспечение того, чтобы фоновые показания выполнялись в тех же локальных точках скважин, что и во время эксперимента, имеет решающее значение для воспроизводимости и стабильности записей.
Оптимизация z-позиции и усиления являются необходимыми шагами, которые должны быть созданы для каждой различной концентрации флуоресцентного красителя, который будет использоваться. Это предотвратит высокую изменчивость межэкспериментов. После настройки наш результат обеспечивает стабильные и воспроизводимые результаты. Одной из причин этого является то, что красители добавляются на апикальной поверхности на клетках в небольшом объеме жидкости, которая легко абсорбируется эпителием, оставляя однородно помечены ASL. Другой метод для окрашивании ASL, который может быть столь же успешным, используется сухой порошок или “подвеска” в PFC. Хотя это может быть экономия времени (как эксперименты, как правило, выполняются в течение 2 ч), маловероятно, что сухие красители полностью растворить в ASL и, таким образом, может быть образуют сгустки. Таким образом, различные концентрации рН-чувствительных красителя будут найдены на поверхности эпителиальных клеток.
Калибровка pH in situ является важным шагом для получения точных, воспроизводимых результатов. Как показано и объясняется в разделе результатов, различия в объемах ASL будут влиять на количество флуоресценции и, следовательно, интерполированные значения рН(Рисунок 2 и Рисунок 3). В то время как различные группы ранее опубликовали ASL pH измерений, широкий спектр значений были получены даже между различными исследованиями, опубликованными одной и той же группой8,17. Мы считаем, что, выполняя в situ калибровки, результаты станут более воспроизводимыми. По сравнению с другими методами калибровки рН, которые используют высокий Метод калибровки K /nigericin (или нескольких ионофоров) для создания стандартной кривой28,29,30, анализа, представленного здесь, имеет преимущество, что , до тех пор, как каждый шаг выполняется в шкаф безопасности, клетки, используемые для ASL рН можно мыть, хранить и повторно использовать для других экспериментов при условии, что лечение выполняется не обратимо влияют на эпителиальные клетки.
Разработка и оптимизация этого исследования обеспечила воспроизводимые результаты, и мы считаем, что этот метод поможет другим группам с их ASL измерения рН. Тем не менее, этот метод имеет также некоторые ограничения из-за создания и тип клеток, которые используются. Мониторинг ASL рН в течение более длительного периода времени, чем представленные здесь (Зgt;8-10 ч) может оказаться трудным, как долгосрочные высокой влажности окружающей среды может повредить оборудование и тот факт, что большинство читателей пластины только предлагают возможность записи кинетических показаний в течение определенное количество времени (обычно 24 ч). Использование полностью дифференцированных первичных hAECs имеет решающее значение в том, что различные этапы дифференциации повлияет на выражение HCO3– и Hq транспортеров. Однако практически нет возможности точно контролировать объем ASL в клетках, выращенных в условиях тонкой пленки. Как указано в протоколе и разделе результатов, изменения в объеме повлияют на коэффициент флуоресценции и, к сожалению, необходимо предположить, что в клетках, выращенных из одного человека, посеянных в один и тот же день на разных полупроницаемых опорах, объемах ASL будет то же самое. В результате этого ограничения, любой агонист или ингибитор, который повлияет на секрецию или поглощение жидкости, повлияет на объем ASL и, предположительно, коэффициенты флуоресценции. Однако, по нашему анализу, кривая калибровки выполняется в конце эксперимента, поэтому мы можем предположить, что эти изменения в объеме повлияют на коэффициенты калибровки так же, как во время кинетического эксперимента. По этой причине мы советуем группам, которые были бы заинтересованы в разработке этого асссе, использовать по крайней мере 2-3 репликации на тестируемое состояние, поскольку это позволит создать стандартную кривую для каждого состояния.
Здесь мы представляем простой, полуавтоматический, анализ, который позволяет в режиме реального времени измерения слизистой поверхности рН в условиях тонкопленки. Он обладает потенциалом для изучения динамических ответов рН во многих культурах практически одновременным образом, что позволяет проводить меж- и внутридонорские сравнения. Увеличение этого метода до 96 хорошо пластины формата с использованием поляризованной системы (HTS 96 пластин)38 обеспечит еще более высокую пропускную вычисляемую как ассс открытия наркотиков. Кроме того, мы показали, как этот метод может быть использован для изучения острого влияния агонистов на ASL рН, и мы уже опубликовали, что этот метод может быть использован для изучения долгосрочного эффекта апикического ингибитора протонного насоса на CF hAECs ASL39. Как рН было показано, чтобы регулировать инфекцию, воспаление, вязкость слизи и ионного транспорта, выявление молекулярных целей, которые могут увеличить рН будет иметь важное значение в области исследований хронических заболеваний легких, и этот метод будет потенциально облегчить развитие скрининга лекарственных средств в персонализированных медицинских подходах. Наконец, поскольку дисрегуляция в кислотной основе гомеостаза играет важную роль в других заболеваниях, этот протокол может быть адаптирован, с оптимизацией шаги, к различным оборудованием (пластины считывателей) и типов клеток, таких как другие эпителиальные клетки. Внеклеточной кислотности является характеристикой рака40,41,42, и это анализ может помочь определить, как твердые опухоли производят низкий рНe или могут быть использованы в качестве низкой пропускной способностью наркотиков скрининга анализ для восстановление рН гомеостаза. Аналогичным образом, что касается хронических заболеваний дыхательных путей, то она может также служить платформой для разработки персонализированного подхода к медицине.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана двумя грантами CF Trust Strategic Research Centre (SRC003 и SRC013) и Советом по медицинским исследованиям (MRC) «Доверие к концепции гранта» (MC-PC-15030). JG была поддержана грантом Фонда медицинских исследований (MRF-091-0001-RG-GARNE). МБ была поддержана Медицинским исследовательским советом Клинического Научного Стипендия (MR/M008797/1). IH была поддержана Стипендией wellcome Trust Clinical Training Fellowship (203520/no/16/) Исследование было поддержано Национальным институтом медицинских исследований Ньюкасл биомедицинских научно-исследовательский центр, базирующийся в Ньюкасл больницы NHS Фонд Trust и Ньюкаслского университета. Высказанные мнения являются мнениями автора (ы) и не обязательно мнения ГСЗ, NIHR или Департамента здравоохранения. Первичные клетки доктора Ранделла были поддержаны грантом Фонда муковисцидоза (BOUCHE15R0) и грантом NIH (P30DK065988).
0.2 µm syringe filter | Starlab | E4780-1226 | |
6.5 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3470 | |
CaCl2 | Sigma Aldrich | 21115 | |
CFTRInh172 | RnD Systems (Tocris) | 3430 | Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 20 µM |
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3524 | |
dextran-coupled pH-insensitive fluorescent dye: AlexaFluor488-dextran | ThermoFisher | D22910 | Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL |
dextran-coupled pH-sensitive fluorescent dye: pHrodo-dextran | ThermoFisher | P10361 | Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL |
D-glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
Forskolin | RnD Systems (Tocris) | 1099 | Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 10 µM |
Greiner CELLSTAR 96 well plates | Cellstar | 655180 | |
Humidity cassette | TECAN | 30090495 | |
KCl | Sigma Aldrich | P9541 | |
MES | Sigma Aldrich | M3885 | |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
NaHepes | Sigma Aldrich | H3784 | |
Plate reader: TECAN SPARK 10M | TECAN | 30086375 | |
Tris | Sigma Aldrich | T1503 | |
Universal pH electrodes DJ 113 | VWR | 662-1385 |