JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Deutsch

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Real-Time, halbautomatisierte Fluoreszenzmessung der Luftbogenoberfläche Liquid pH der primären menschlichen Luftweg-Epithelzellen

Published: June 13, 2019
doi:
10.3791/59815
, , , , , ,
1Epithelial Research Group, Institute for Cell and Molecular Biosciences, Faculty of Medical Sciences,Newcastle University, 2Respiratory Group, Institute of Cellular Medicine, Faculty of Medical Sciences,Newcastle University, 3Paediatric Respiratory Medicine, Great North Children’s Hospital,Newcastle upon Tyne Hospitals NHS Foundation Trust, 4Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co

Summary

Wir stellen ein Protokoll vor, um dynamische Messungen der Atemwegsflüssigkeit pH unter Dünnschichtbedingungen mit einem Plattenleser zu machen.

Abstract

In den letzten Jahren wurde die Bedeutung der Schleimhautoberfläche pH-Wert in den Atemwegen durch ihre Fähigkeit, die Flüssigkeit (ASL) der Atemwege zu regulieren, die Flüssigkeit, die Viskosität und die Aktivität der antimikrobiellen Peptide, Schlüsselparameter, die bei der angeborenen Verteidigung der Lunge. Dies ist von primärer Relevanz im Bereich chronischer Atemwegserkrankungen wie der zystischen Fibrose (CF), wo diese Parameter dysreguliert sind. Während verschiedene Gruppen ASL pH sowohl in vivo als auch in vitro untersucht haben, berichten ihre Methoden von einer relativ breiten Palette von ASL-pH-Werten und sogar widersprüchlichen Befunden über etwaige pH-Unterschiede zwischen NichtCF und CF-Zellen. Darüber hinaus liefern ihre Protokolle nicht immer genügend Details, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, die meisten sind niedriger Durchsatz und erfordern teure Geräte oder Fachwissen, um sie umzusetzen, was sie in den meisten Labors schwierig zu etablieren macht. Hier beschreiben wir einen halbautomatisierten Leuchtstoffplattenleser-Assay, der die Echtzeitmessung von ASL pH unter Dünnschichtbedingungen ermöglicht, die der In-vivo-Situation näher kommen. Diese Technik ermöglicht stabile Messungen für viele Stunden von mehreren Atemwegskulturen gleichzeitig und, was wichtig ist, können dynamische Veränderungen im ASL-pH-Wert als Reaktion auf Agonisten und Inhibitoren überwacht werden. Um dies zu erreichen, werden die ASL der vollständig differenzierten primären menschlichen Atemwegepithelzellen (hAECs) über Nacht mit einem pH-empfindlichen Farbstoff befleckt, um die Rücknahme der überschüssigen Flüssigkeit zu ermöglichen, um dünne Folienbedingungen zu gewährleisten. Nachdem die Fluoreszenz in Anwesenheit oder Abwesenheit von Agonisten überwacht wird, wird die pH-Kalibrierung vor Ort durchgeführt, um die Volumen-und Farbstoffkonzentration zu korrigieren. Die beschriebene Methode bietet die erforderlichen Kontrollen, um stabile und reproduzierbare ASL-pH-Messungen zu machen, die letztlich als Medikamentenentdeckungsplattform für die personalisierte Medizin verwendet werden könnten, sowie an andere epitheliale Gewebe und experimentelle Zustände, wie entzündliche and/oder Wirt-Erreger-Modelle.

Introduction

Das Ufay-Epithel wird von einer dünnen (~ 10 μm) Flüssigkeitsschicht bedeckt, die als Luftwegoberflächenflüssigkeit (ASL) bezeichnet wird. Die Zusammensetzung und Tiefe (Hydration) dieser ASL ist streng reguliert und kontrolliert die Effizienz der Atemwege durch die Mucociliary Rolltreppe1,2,3,4. In den letzten Jahren wurde die Bedeutung des ASLH +/HCO3– Inhalt von verschiedenen Gruppen aufgrund seiner Fähigkeit, ASL-Hydratation5, Atemwegentzündung 6 und Infektion 7 zu regulieren,nachgewiesen, 8 sowie Schleimviskosität8,9. Wichtig ist, obwohl es einige Kontroversen gibt, viele Studien berichteten von einer Dysregulation des pH-Wertes bei chronischen Atemwegserkrankungen wie Asthma10, 11, 12,COPD11, Bronchiectasis11, chronische Rhinosinusitis13,14 und zystische Fibrose (CF)5, 9,15,16, 17,die Andeuten, dass Therapien, die ASL-pH-Wert wiederherstellen, nützlich sein könnten, um mehrere Arten von chronischen Atemwegserkrankungen zu behandeln. CF ist die häufigste autosomal-rezessive genezessive Erbkrankheit in kaukasischen Populationen und ist auf Mutationen im CF Transmembran-Leitungshandlungsregler (CFTR) zurückzuführen. Dieses Gen kodiert einen Anionkanal (HCO3– und Cl–), der eine entscheidende Rolle im Ionen-und Flüssigkeitstransport und bei der HomöostaseüberEpithelia 18 spielt. Obwohl CF eine Multiorganerkrankung ist, ist die Lungenpathologie die Hauptursache für MorbiditätundMortalität 19,20und wenn man bedenkt, dass der primäre Defekt in CFein beeinträchtigter Transport von Cl-und HCO3–ist, Man kann vermuten, dass extrazelluläre Flüssigkeit pH bei Menschen mit CF wird dysreguliert im Vergleich zu Menschen, die nicht CF haben. So ist die Messung von ASL pH ein aktueller Bereich der CF-Forschung und verschiedene Gruppen haben Techniken entwickelt, um ASL pH in CF zu messen Airways.

In vivo wurde der pH-Wert der Luftfahrt mit verschiedenen Techniken gemessen, von Mikrosonden (Glasfaser-, Gold-oder Mobidiumsonden)5,21,22, 23,24 biszu pH-Messungen von Erwartbares Material oder ausgeatmete Atemkondensat (EBC)10,11,12,25,26,27. Im Forschungsbereich CF wird der pH-Wert aufgrund seiner möglichen klinischen Implikationen umfassend untersucht. Theoretisch könnte eine alkalische Verbesserung der Atemwege die bakterielle Tötung erhöhen und die Homöostase der Schleimhaut und der Atemwege insgesamt verbessern. In vivo/ex-vivo-Studien wird jedoch von einer breiten Palette von pH-Werten berichtet, und bis heute sind die Ergebnisse nicht schlüssig, was das Vorhandensein eines Unterschieds im pH-Wert zwischen Nicht-CF-und CF-Luftwegen betrifft. Anfang der 2000er Jahre meldeten verschiedene Gruppen den pH-Wert der EBC. In nicht erkrankten Gruppen lagen die pH-Werte zwischen 4,6 und 8,5, aber interessanterweise wurde EBC pH bei Verschärfungen bei Menschen mit CF12,27saurergefunden. In jüngerer Zeit haben in vivo Messungen der ASL in Mensch und Tier Modelle der CF berichtet widersprüchliche Ergebnisse 16,17, 21,22,23 , 24 und es ist immer noch unklar, ob CF-Atemwege saurer sind als nicht-CF-Luftwege.

Da sich in vivo die Messung des unteren ASL-pH-Wertes als schwierig erwiesen hat, da die Atemwege sehr gering sind und das Vorhandensein von Schleimhautstecker bei Krankheiten besteht, haben sich viele Gruppen an In-vitro-Experimente gewandt, um ASL-pH-Maßnahmen zu messen, vor allem mit drei verschiedenen Methoden. Der erste Ansatz verwendet dextrangekoppelte zell-impernbare pH-empfindliche Fluoreszenzfarbstoffe,die als Trockenpulver hinzugefügt werden, entweder direkt in die ASL oder durch die Verwendung einer Inertflüssigkeit namens Perfluorkohle (PFC)5,8,16 , 17 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. Diese Technik bietet jedoch wenig Kontrolle über die genaue Menge des Farbstoffs, der den Kulturen zugesetzt wird, und birgt die Gefahr von Farbstoffaggregaten und großen Konzentrationsunterschieden zwischen Proben und/oder Experimenten und sogar innerhalb derselben Probe. . Es wurde auch in der Regel mit einem konfokalen Mikroskop durchgeführt, das seine Anwendbarkeit einschränkt und in vielen Fällen eine detaillierte Überwachung mehrerer Proben und Veränderungen der Aufzeichnungsbedingungen verhindert. Die zweite Methode zur Messung von ASL pH ist der Einsatz von pH-empfindlichen Mikroelektroden5,15. ASL-pH-Messungen sind daher nicht von der fluoreszierenden Farbstoffkonzentration abhängig und sollten robustere und reproduzierbare Ergebnisse liefern. Diese Methode erlaubt jedoch keine dynamischen Echtzeitmessungen des ASL-pH-Wertes und ist auch nicht einfach, mehrere Messwerte unter verschiedenen Bedingungen durchzuführen. Es handelt sich auch um ein arbeitsintensives, komplexes Verfahren, das eine spezielle Ausrüstung (Mikroelektrodenfabrikation/elektrophysiologische Aufzeichnungsgeräte) und eine Schulung für die Sammlung der Proben für die anschließende pH-Messung und-Kalibrierung erfordert. Darüber hinaus haben diese beiden Techniken auch einige Ungereimtheiten in der Fähigkeit gezeigt, reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen: Mit der pH-empfindlichen Leuchtstofffarbstoffmethode, Tang et al. berichtete Werte von 7,35 für Nicht-CF ASL und 7.0für CF ASL 8, während in einem mehr Zuletzt wurde der ASL pH von der gleichen Gruppe mit 6,9 und 6,4 für Nicht-CF und CF,jeweils 17, bewertet. In ähnlicher Weise gaben Mikroelektrodenmessungen in einer Studie von 2003 15 Werte von 6,4 in non-CF ASL und 6,1 in CF ASL, während die gleiche Gruppe in einer Studie von 20135Werte von 6,7 für Nicht-CF ASL und 6,45 für CF ASL meldete. Schließlich fügen die Forscher im dritten Ansatz eine relativ große Menge schwach gepufferter Lösungen auf die apische (Schleimhaut) Oberfläche der Kulturen hinzu, wodurch dünne Filmbedingungen zerstört werden und die ASL-Zusammensetzung verändert wird, und möglicherweise auch ihre Regulierung. Der pH-Wert wird dann entweder mit pH-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoffen 33, durch eine pH-stat-Tittrationsmethode in einer Ussing-Kammer13, 14,gemessenoder erfordert, dass der verdünnte ASL aus den Kulturen entfernt und pH mit einem pH gemessen wird. Elektrode,Analysator oder Lackmu-Streifen 34. Eine weitere Schwierigkeit bei der genauen Messung des ASL-pH-Wertes ist die Etablierung einer möglichst genauen Standardkurve. In der Tat, ob die Messwerte mit einer Elektrode durchgeführt werden, die den Unterschied des elektrischen Potenzials über ein Harz oder mit pH-empfindlichen Leuchtstofffarben messen wird, werden beide Ansätze durch die lokale Mikroumgebung der Proben beeinflusst werden. gemessen. Genauer gesagt kann die Dissoziationskonstante (Kd) der Farbstoffe je nach Temperatur, ionischer Stärke, Viskosität sowie möglichen Wechselwirkungen des Farbstoffs mit zellulären Bestandteilen wie Proteinen und potentiellem Schleim erheblich variieren.

Um zu versuchen, viele dieser technischen Probleme zu überwinden und eine dynamischere, einfachere und höhere Durchsatzmethode zu entwickeln, haben wir eine In-vitro-Technik entwickelt, die ASL pH in primären hAEC-Kulturen mit einem zellimpernlichen pH-sensiblen Leuchtstofffarbstoff in einem handelsüblichen Plattenleser. Die Methode erzeugt reproduzierbare, dynamische, halbautomatische Echtzeitmessungen des ASL pH voll differenzierter 3D-Zellkulturen unter Dünnschichtbedingungen. Durch den Einsatz eines mehrwell-Plattenlesers kann dieser halbautomatische Test nahezu gleichzeitige pH-Messungen für bis zu 24 Bedingungen über 12 h durchführen und die Wirkung verschiedener Agonisten oder Inhibitoren überwachen. In diesem Beitrag beschreiben wir die Methodik im Detail und berichten repräsentative Ergebnisse unter positiven und negativen Kontrollbedingungen, die die Technik bestätigen.

Protocol

Primäre Nicht-CF (n = 3 Spender, Im Alter von 34, 27 und 23 Jahren) und CF (n = 3 Spender, alle F580del/F508del; 40, 440, 41, unbekannt) waren hAECs ein freundliches Geschenk von Dr. Scott H. Randell (Marsico Lung Institute, The University of North Carolina at Chapel Hill, United States) und waren obtai Im Protokoll #03-1396, das von der University of North Carolina im Chapel Hill Biomedical Institutional Review Board genehmigt wurde. Die Zellen wurden nach den zuvor veröffentlichten Methoden mit den von Fulcher und Randell 35,36beschriebenen Wachstums-und Differenzierungsmedien angebaut. 1. Probenvorbereitung Wachsen Sie die primären hAECs auf einem Durchmesser von 6,5 mmhalbdurchlässige Stützen (Materialtabelle) für mindestens 28 Tage an derLuft flüssig, wie zuvor beschrieben35,36. Bereiten Sie 50 ml sterile Lösung von HCO3 vor -mit Krebs Pufferlösung (HCO 3- KRB,Konzentrationen werden in mM NaHCO3 (25) NaCl (115), KCl (5), CaCl 2 (1), MgCl2 (1), D-glucose-5) gegeben). Und Filtersterilize mit einem 0,2 μm Spritzenfilter. Ändern Sie das bäuerliche Medium auf ein frisches Differenzierungsmedium, wie in 1.135,36beschrieben.NOTE: Es hat sich gezeigt, dass die basolaterale Glukosekonzentration ASLpH 33beeinflusst. In dieser Phase kann der Glukosegehalt des Basolateralraums durch gepufferte Lösungen bekannter Glukosekonzentrationen gesteuert werden. Waschen Sie die apische Oberfläche der Zellen, indem Sie 150 μL HCO3- KRB hinzufügen und bei 37 ° C 20 Minuten inkubieren, 5% CO2. Entfernen Sie die apische Wäsche, ohne das Epithel zu stören, indem Sie es vorsichtig mit einem sterilen Glas Pasteur-Pipet und einer sterilen P200-Pistinspitze, die mit einer Aspirationspumpe verbunden ist, die ein Vakuum in der Sammelflasche erzeugt, saugen. In dieser Phase sollte möglichst wenig Flüssigkeit auf der apischen Oberfläche verbleiben, um die luftflüssigkeitsoberflächliche Schnittstelle wiederherzustellen. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 30 Minuten bei 37 ° C, 5% CO2. 2. Hintergrundmessung Schalten Sie den Plattenleser und den Computer ein. Öffnen Sie das Armaturenbrett. Klicken Sie auf Spark 10M,öffnen Sie die Temperaturregelung und setzen Sie auf 37 ° C. Öffnen Sie die Gassteuerung und setzen Sie den CO2 bis 5%. Warten Sie, bis Temperatur und CO2 ihre Ziele erreicht haben. Öffnen Sie die Plattenleser-Schublade, legen Sie die Feuchtigkeitskassette mit 6 ml dH2 O aufjeder Seite gefüllt. Stellen Sie sicher, dass Deckel und Boden der Platte sauber sind – wenn nicht, sauber mit 70% Ethanol auf einem Stück Gewebe-und legen Sie die Platte in die Feuchtigkeitskassette.NOTE: Während des gesamten Experiments wird der Deckel der Gewebekultur auf dem Teller aufbewahrt und nur beim Hinzufügen von Medikamenten oder beim Wechsel des bäuerlichen Mediums entfernt, die in einer Gewebekultur laminare Strömungshaube durchgeführt werden, um die Kulturen in einer sterilen Umgebung zu halten. Öffnen Sie den Spot-Methode-Editor und stellen Sie die Parameter auf der Software wie folgt fest: Wählen Sie die passende Plattenschablone (für die halbdurchlässigen Stützen mit 6,5 mm Durchmesser, wählen Sie die 24 Brunnenplatten) und die Brunnen, die während dieses Experiments überwacht werden. Fügen Sie eine Temperatur und eine CO 2-Steuerung hinzu und stellen Sie sie auf 37 ° C bzw. 5%. Zecken Sie das Warten auf temperature/Gaskästen . Fügen Sie ein kinetisches Loop-Panel hinzu und wählen Sie die Dauer als Loop-Typ aus und setzen Sie sie auf 5-10 min.Hinweis: Der Zeitpunkt des kontinuierlichen Lesens hängt von der Anzahl der gut/mierten Bedingungen ab. 5 min ist lang genug für 6-12 Brunnen, während eine Vollplatte mit 24 Bedingungen 10 Minuten kontinuierliche Messungen erfordert. In der kinetischen Schleife zwei “Fluoreszenzintensität”-Panels mit Hilfe der Drag-and-Drop-Funktion, die für die pH-empfindlichen bzw. pH-unempfindlichen Fluoreszenzfarbstoffe eingerichtet wird. Setzen Sie Anregung und Emissionswellenlängen auf 560 bzw. 590 nm, für den pH-empfindlichen Farbstoff bzw. 495 bzw. 520 nm für den pH-unempfindlichen Farbstoff. Stellen Sie die Anzahl der Blitze auf 30 und die z-Position auf 33200 für jedes Fluorophor.Hinweis: Die z-Positions-und Gain-Einstellungen sind abhängig von den Eigenschaften des Plattenlesers. Stellen Sie den Gewinn manuell auf einen Wert, der hoch genug zählt, so dass die Unterschiede zwischen den Samples aufgenommen werden, aber niedrig genug, so dass die Zugabe eines Agonisten keine Werte aus dem Bereich der Erkennung generiert. Stellen Sie das Multi-Resen pro gut auf den Benutzer, der als Kreistyp von 3 × 3 Größe mit einer Grenze von 4750 μm definiert ist. Klicken Sie auf den Startknopf, um eine Hintergrundmessung zu erstellen und OK, um den Deckel der Feuchtigkeitskassette zu bestätigen. Am Ende der Messung öffnen Sie die Plattenleser-Schublade, nehmen Sie die Platte heraus und legen Sie den Zellsit zurück in den Inkubator, während Sie die fluoreszierende Farbstoffmischung Lösung vorbereiten. Bereiten Sie die Leuchtstofffleisch-Mix-Lösung vor, indem Sie 2 μL von 1 mg/mL dextran-gekoppelte pH-sensitive (pHsens) Leuchtstofffarbstoff auf 0,2 μL hinzufügen. Von 10 mg/mL dextrangekoppelten pH-unempfindlichen (phins) fluoreszierenden Farbstoff und 0,8 μL sterilen HCO3- KRB für ein Finale Volumen von 3 μL pro Zustand.Hinweis: Das Gesamtvolumen der Farbstoffmischlösung sollte für n Brunnen + 1 vorbereitet werden, wenn es zwischen 1 und 10 Proben gibt, oder n Brunnen + 2, wenn es zwischen 11 und 24 Proben gibt. Dextran-gekoppelte Farbstoffe werden in filter-steriler HCO3- KRB-Lösung rekonstituiert, bei-20 ° C alitiert und gelagert. Jede Chemikaliekann in dieser Phase für eine 16-24 h Inkubationszeit 37 auf der apischen Oberfläche hinzugefügt werden. Chemikalien sollten als 0,1x aufbereitet werden, da das endgültige Volumen, nach der Aufnahme der überschüssigen Flüssigkeit durch die Kultur, wird etwa 0,3 μL für eine 6,5 mm Durchmesser halbdurchlässige Unterstützung. Fügen Sie vorsichtig 3 μL Farbstoffmischung (siehe 2,8) auf die apische Oberfläche der Zellen und inkubieren Sie über Nacht bei 37 ° C, 5% CO2. 3. Kinetische Messung Wiederholen Sie die Schritte 2.1 bis 2.4, um den Plattenleser vorzubereiten. Klicken Sie auf das Open Icon und wählen Sie die Methodendatei aus, die für die Hintergrundmessungen verwendet wird. Halten Sie den Loop-Typ im kinetischen Loop-Top als Dauer und setzen Sie ihn auf 08 Stunden. Ändern Sie den Intervall-Typ auf Fixed und setzen Sie ihn auf 5 Minuten. Halten Sie die Fluoreszenz-Intensität der Panels wie bei den HintergrundmessungenHinweis: Der Intervalltyp für Hintergrundmessungen ist auf “nicht definiert” gesetzt, um ein kontinuierliches Lesen zu ermöglichen. Auch für kinetische Experimente und Kalibrierungsversuche wird der Intervalltyp mit einem Intervall von 5 min auf “fixiert” gesetzt. Dies lässt sich je nach Ausgestaltung des Experiments und Anzahl der Bedingungen anpassen. Öffnen Sie die Teller Lesegeräte; Die Feuchtkassette mit 6 ml dH2 O aufjede Seite geben. Stellen Sie sicher, dass der Deckel und der Boden der Platte sauber sind – wenn nicht, sauber mit 70% Ethanol auf einem Stück Gewebe-und legen Sie die Platte in die Feuchtigkeitskassette mit ihrer Abdeckung. Beginnen Sie die Fluoreszenz-Lesungen, indem Sie auf Start klicken. Klicken Sie auf OK, nachdem Sie den Deckel der Feuchtigkeitskassette sicher haben. Nach n Zyklen, in der Regel zwischen 12 und 24, was 1 bis 2 Stunden entspricht, klicken Sie auf Pause, um das Experiment zu unterbrechen. Nehmen Sie die Platte heraus und wenden Sie alle Drugs/Agonisten basolateral auf die verschiedenen Proben.Hinweis: Wenn die Zellen aus dem Plattenleser herausgenommen werden, entweicht CO2 , was zu einer Erhöhung des ASL-pH-Wertes führt, wie ein Rückgang der pH-empfindlichen Farbstofffluoreszenz zeigt. Dieser CO2-induzierte pH-Wechsel kehrt sich innerhalb von 10-15 Minuten nach dem Einlegen der Kulturen wieder in den Plattenleser. Legen Sie die Platte zurück in die Feuchtigkeitskassette auf das Tablett, positionieren Sie den Feuchtigkeits-Kassettendeckel neu und klicken Sie auf Weiter, um ASL pH weiter zu erfassen und die Wirkung der Drugs/Agonisten auf ASL pH zu überwachen. 4. In situ pH-Kalibrierung Den Teller aus dem Teller nehmen. Aspiration die basolaterale medium/Lösung. Fügen Sie 750 μL und 1 μL hochgepufferte Standardkurvenlösungen in das Basolateralfach bzw. die apische Oberfläche ein.Hinweis: Hochgepufferte Standardkurvenlösungen enthalten (in mM) NaCl (86), KCl (5), CaCl 2 (1,2), MgCl 2 (1.2), NaHEPES oder MES oder Tris (100 mM). Verwenden Sie MES, um Lösungen mit einem pH-Wert von weniger als 7, NaHEPES für Lösungen von pH 7-7.5 und Tris für die Lösung mit pH 8 zu puffern. Klemmen Sie den pH-Wert mit HCl auf den gewünschten Wert. Schalten Sie den CO2 auf den Plattenleser oder setzen Sie ihn auf 0,1% und legen Sie die Platte wieder in die Feuchtigkeitskassette. Richten Sie den Plattenleser mit den gleichen Parametern ein, wie zuvor beschrieben, aber ohne CO 2 wie in Schritt 3.2. Beginnen Sie die Fluoreszenzwerte, alle 5 Minuten für 1-1,5 Stunden. 5. Bewertung der Wirkung von Farbstoffkonzentration und Aufhängungsvolumen auf Kalibrierungsdaten Bereiten Sie genug pH-empfindliche und unempfindliche Farbstoffgemisch vor, um die Fluoreszenz auf mindestens 4 verschiedene pH-Werte in 3 verschiedenen Volumina zu erfassen.NOTE: Hier wurde Mix 1 mit 26 μL pH-sensitive (1 mg/mL) und 2,6 μL pH-insensitive (10 mg/mL) und Mix 2 mit 13 μL pH-sensitive (1 mg/mL) und 1,3 μL pH-insensibel (10 mg/mL) vorbereitet. Verteilen Sie 2,2 μL oder 1,1 μL Mix 1 bzw. Mix 2 in 12 Brunnen einer 96-Brunnenplatte und fügen Sie genügend Kalibrierungslösungen hinzu, um endgültige Volumina von 50, 100 oder 200 μL zu erhalten und gut zu mischen.NOTE: In diesem Setup werden Fluoreszenzzählungen für Konzentrationen von Farbstoffen von 5 μg/mL (in 200 μL), 10 μg/mL (in 100 oder 200 μL), 20 μg/mL (in 50 oder 100 μL) oder 40 μg/mL (in 50 μL) erfasst. Schalten Sie den Plattenleser ein, stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C ein und legen Sie die Platte in den Plattenleser. Schalten Sie den CO2-Controller nicht ein.Achtung: Da es sich um ein kurzes Experiment handelt und nur genügend Zeit benötigt, um die Temperatur auszugleichen, ist die Feuchtigkeitskassette nicht erforderlich. Passen Sie die z-Position an und gewinnen Sie für die 96-Brunnenplatte und verwenden Sie die gleichen Parameter wie für das Experiment, das auf halbdurchlässigen Stützen durchgeführt wird. 6. Datenanalyse Speichern Sie alle Daten in Tabellenkalkulationen und erstellen Sie eine neue Datei. Wählen Sie in der Hintergrunddatei alle mittleren Daten für jede sample/Bedingung für beide Wellenlängen aus, kopieren und fügen Sie sich in die neue Datei ein. Berechnen Sie den mittleren Hintergrund für jeden Brunnen und jede Wellenlänge. Wiederholen Sie dies mit den Kalibrierungs-und kinetischen Daten und subtrahieren Sie den Hintergrund von jedem Datenpunkt für jede Wellenlänge. Berechnen Sie für jeden Zeitpunkt und jede Probe das Verhältnis zwischen pH-sensibler und pH-unempfindlicher Fluoreszenz Wenn alle Proben von einem einzelnen Spender erhalten wurden, berechnen Sie den Mittelwert der Verhältnisse zu jedem Zeitpunkt der KalibrierkurveNOTE: Es ist wichtig, so viele Kalibrierkurven zu generieren wie Spender oder Basolaterallösungen. In der Tat können diese Parameter die Hintergrundwerte oder die Rate der Aufnahme der Flüssigkeit beeinflussen, was wiederum die Farbstoffkonzentration und damit den berechneten pH-Wert beeinflussen wird. Generieren Sie für jeden Zeitpunkt eine Standardkurve aus den Verhältnissen, indem Sie die bekannten pH-Werte auf der x-Achse und die Verhältnisse auf der y-Achse zeichnen. Bestimmen Sie den Zeitpunkt, an dem die Verhältnisse stabil sind, passen Sie zu einer linearen Regressionslinie und erhalten Sie die Gleichung für diese Linie. Berechnen Sie aus den kinetischen Daten den pH-Wert für jeden Zeitpunkt und zeichnen Sie den pH-Wert auf der y-Achse und die Zeit auf der x-Achse aus.Hinweis: Die Wiederherstellung des pH-Wertes kann berechnet werden, indem man Datenpunkte über die stabile Messung des pH-Wertes vor dem Zusatz eines Agonisten oder eines anderen Eingriffs durchschnitt. Die Wirkung eines Agonisten kann durch die Berechnung der Differenz im pH-Wert vor und nach (einer bestimmten Zeitspanne) der Behandlung oder durch die Anpassung einer nicht-linearen Kurve an die Datenpunkte direkt nach dem Eingriff gekennzeichnet werden. Dies gibt zusätzliche Informationen über den t 1/2 und den Maximalwert. Schließlich können die Versauerungs-oder Alkalinierungsraten auch aus dem Hang einer geraden Linie gewonnen werden, die an den ersten Punkten nach dem Eingriff angebracht ist.

Representative Results

Die oben beschriebene Technik ermöglicht die dynamische Messung von ASL pH in bis zu 24 separaten primären hAECs Kulturen. Abbildung 1 zeigt ein Schema der Hauptschritte und der Einrichtung. Die abendverzierten Zellen werden in einen CO2 -und temperaturgesteuerten Plattenleser gelegt, in dem alle 5 Minuten Fluoreszenz von dextran-gekoppelten pH-empfindlichen und pH-unempfindlichen Farbstoffen aufgezeichnet wird. Abbildung 1: Schematische ASL-pH-Messmethode. Nach dem Waschen der Kulturen und der Durchführung einer Hintergrundlektüre werden die primären menschlichen Atemweg-Epithelzellen (hAECs) ASL über Nacht bei 37 ° C, 5% CO2mit dextran gekoppelten pH-empfindlichen und pH-unempfindlichen Farbstoffgemisch beladen. Am darauffolgenden Tag wird die Platte auf eine Temperatur und CO2-gesteuerter Plattenleser übertragen und die Fluoreszenz von beiden Farbstoffen wird im Laufe der Zeit aufgezeichnet. Nach dem Experiment wird eine In-situ-Kalibrierung durchgeführt und Daten analysiert und im Laufe der Zeit als ASL-pH dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Zunächst untersuchten wir die Auswirkungen verschiedener Volumina und Farbstoffkonzentrationen auf die Fluoreszenzzahlen und damit auf das Verhältnis 560/495. In der Tat ist der Zweck, den pH-unempfindlichen Farbstoff zu addieren, die Variabilität in der ASL-Beladung zu korrigieren. Es war jedoch wichtig, diese Annahme zu testen und zu bewerten, ob wir eine Standard-Kalibrierungskurve verwenden können, die in Ermangelung von Zellen in einer 96-Brunnenplatte für alle Experimente und Zelltypen durchgeführt wurde. Wir haben die Fluoreszenzzahlen von über 1 h in 50, 100 oder 200 μl Kalibrierungslösungen (bei pH 5,6,6,7 oder 8) mit 5, 10, 20 oder 40 μg/mL Farbstoffen überwacht. Die Ergebnisse werden in Abbildung 2A-C dargestelltund zeigen, dass bei dem gleichen pH-Wert und der gleichen Farbstoffkonzentration das gemeldete pHsens/pHins-Emissionsverhältnis (560/495 auf der y-Achse) je nach Volumen (Abbildung2A) unterschiedlich ist. Zusätzlich ergeben unterschiedliche Farbstoffkonzentrationen bei gleichem pH-Wert und gleichem Volumen unterschiedliche Verhältniswerte (Abbildung 2B). Daher wirken sich Veränderungen der Volumen-oder Farbstoffkonzentration auf den absoluten Wert des pH-Wertes aus dem Emissionsverhältnis aus. Abbildung 2C zeigt , dass die Zeit für die Temperaturausgleich etwa 15-20 min beträgt. Um die Wirkung von Farbstoffkonzentration und-volumen auf die Emissionsverhältnisse zu bestätigen, haben wir Fluoreszenz von Farbstoffen aufgenommen, die in der ASL der primären Nicht-CF und CF hAECs vor Ort geladen wurden. Wir haben dann die Kalibrierung durchgeführt und die Ergebnisse analysiert, indem wir (1) aus allen Proben eine globale Standardkurve generiert haben oder (2) für jeden Zelltyp (Non-CF und CF) zwei unabhängige Standardkurven erzeugt haben. ASL pH von beiden Zelltypen wurden dann mit der Zeit (Abbildung 3A, B) und durchschnittlich (Abbildung 3C) gezeichnet. Die pH-Werte, die aus einer einzigen globalen Standardkurve gewonnen wurden, zeigten einen signifikanten Unterschied zwischen den nicht-CF-und den CF-Kulturen (Abbildung 3A,C), während ASL-pH-Wert bei der Berechnung aus dem pH-Wert nicht signifikant zwischen CF und Nicht-CF hAECs unterschied. Unabhängige Standardkurven (Abbildung 3B,C). Diese Ergebnisse zeigen, wie wichtig es ist, unabhängige Kalibrierkurven für jedes Experiment und im Rahmen des Experiments, für jede Spenderprobe zu erzeugen, denn wenn die Kalibrierkurven zusammen gemittelt wurden, wurden in den CF-Kulturen höhere pHsens/pins-Verhältnisse gefunden. , mit einem saureren pH-Wert (Abbildung 3C). Abbildung 2: Optimierung der pH-Kalibrierung in vitro. Verschiedene Lösungsvolumina des bekannten pH-Wertes, die unterschiedliche Farbkonzentrationen enthielten, wurden auf eine 96-Brunnenplatte geladen und die Fluoreszenz wurde über1 h aufgezeichnet. Die Ratios wurden mit pH-Wert für Zeit-Punkt 24 min. (C) Die Neigung der Veränderung der Fluoreszenz wurde für jede Lösung berechnet und als Funktion der Zeit (in min) gezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 3: Optimierung der Analyse der pH-Kalibrierung auf primären hAECs vor Ort. (A) repräsentative Spuren des ASL-pH-Wertes, die aus einer einzigen Standardkurve stammen, die Daten aus Nicht-CF und CF-Kulturen durchschnitt. B) repräsentative Spuren des ASL-pH-Wertes, die aus einer unabhängigen Standardkurve gewonnen werden, die an Nicht-CF oder CF-Kulturen durchgeführt wird. Jeder Datensatz wurde aus der eigenen Kalibrierkurve berechnet. C) Bewertung der Unterschiede im ASL-pH-Wert zwischen NichtCF und CF-Kulturen als Funktion der Kalibrierung. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM aus n=3 Experimenten dar, 2-Wege ANOVA, Sidak es multiple Vergleiche Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Um unsere Technik weiter zu validieren, brauchten wir dann eine positive Kontrolle, um zu zeigen, dass die Technik in der Lage war, eine “erwartete” Veränderung des ASL-pH-Wertes zu erkennen. Da das Vorhandensein eines saureren ASL in CF-Zellen immer noch umstritten ist, haben wir den cAMP-Agonisten Forskolin als positive Kontrollbedingung eingesetzt, um die HCO3- Sekretion durch CFTR zu stimulieren. Die zu erwartenden Ergebnisse würden eine forskolininduzierte Alkalinisierung des ASL in Nicht-CF-Zellen zeigen, die in CF-Zellen je nach Schwere der Mutationen weitgehend reduziert oder abgeschafft würde. Abbildung 4A zeigt repräsentative Spuren des ASL-pH-Wertes von Nicht-CF-Zellen und CF-Zellen im Laufe der Zeit und Abbildung 4B zeigt die Mitteldaten des ASL-pH-Wertes vor und nach der Behandlung mit Forskolin in beiden Zelltypen. Aus diesen Ergebnissen können wir unterschiedliche Informationen erhalten. Erstens war der ruhende ASL-pH-Wert, wie bereits in Abbildung 3B,Cgezeigt, nicht zwischen Nicht-CF und CF-Epithelie zu unterscheiden. Zweitens zeigten die ersten 3-4 Zeitpunkte nach dem Aussetzen des Experiments zur Behandlung der Zellen mit Forskolin einen großen Anstieg des pH-Wertes, der sich innerhalb von ~ 15 min erholte. Dies war auf den Rückgang der CO2-Konzentration zwischen dem Plattenleser zurückzuführen (5%) Und der Sicherheitsschrank für Gewebekultur (~ 0%). Nach der Henderson Hasselbalch Gleichung entspricht ein pH-Wert von 7 in einer 5% CO 2-Umgebung einer Konzentration von HCO 3- von ~ 9,3 mM. Wenn die Zellen aus dem Plattenleser entfernt werden, führt ein Rückgang der CO2-Konzentration auf 0% theoretisch zu einer Erhöhung des pH-Wertes von & gt;8. Abbildung 4A zeigt, dass ASL pH auf ~ 7.8 anstieg, was durch den Zeitverzug der Neupositionierung der Platte im Plattenleser (d.h . in einer 5% CO2-Umgebung ) erklärt werden kann. Schließlich, wie vorhergesagt, die Zugabe von Basolateral 10 μM forskolin (Fsk) deutlich erhöht ASL pH nur in Nicht-CF-Kulturen. Wie verschiedene Gruppen gezeigt haben, dass es einen Unterschied in der Gleichgewichtung ASL pH zwischen CF und Nicht-CF-Epithelie gibt, wollten wir weiter untersuchen, ob es in unseren Experimenten keinen pH-Unterschied gibt und welche Rolle CFTR spielt. Dazu haben wir mit dem speziellen CFTR-Inhibitor CFTR inh172 (172) nicht-CF-Kulturen vorinkubiert. Wie im Protokollabschnitt 2.8 angegeben, wurde der Farbstoffmix wie oben angegeben vorbereitet und der Inhibitor bei einer Konzentration von 0,1X = 2 μM hinzugefügt. Der Literatur zufolge beträgt die ASL-Höhe der Nicht-CF-Zellen etwa 10 μm. Bei einer halbdurchlässigen Stütze von 6,5 mm Durchmesser ist das theoretische Volumen des ASL daher × 3,25 2 = 0,3 μL. Durch die Zugabe von 3 μL Farbstoff + 172 bei 2 μM wird die Konzentration des Inhibitors nach der Aufnahme der überschüssigen Flüssigkeit theoretisch 20 μM (1x, gewünschte Konzentration) betragen. Repräsentative Spuren in Abbildung 4C und eine mittlere Zusammenfassung in Abbildung 4D zeigen, dass 172 den ASL-pH-Wert nicht reduziert hat, sondern die forskolinbedingte Erhöhung des ASL-pH-Werses verhindert hat, was unsere Ergebnisse bestätigt, die wir aus Nicht-CF gegen CF gewonnen haben. Kulturen und die weitere Validierung unserer Technik. Abbildung 4: Dynamische ASL-pH-Messung als Reaktion auf CFTR-Aktivierung durch Forskolin. (A) Repräsentative Spuren der Wirkung von Forskolin (Fsk, 10 μM) auf die Kinetik des ASL pH im Laufe der Zeit in Nicht-CF und CF hAECs. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM von n=3 Experimenten dar. (B) Zusammenfassung der Wirkung von Fsk auf ASL pH in Nicht-CF und CF Kulturen. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD aus n=69 Nicht-CF-Kulturen und 35 CF-Kulturen dar (2-Wege-ANOVA, Sidak es multiple Vergleiche Test). C) Repräsentative Spuren der Wirkung von CFTRinh172 (172,20 μM) auf den von der Fsk-induzierten Anstieg des ASL-pH-Wertes bei den nicht-CF-HAECs. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM aus n=5 Experimenten dar. D) Zusammenfassung der Wirkung von 172 auf die Fsk-induzierte Alkalinisierung des ASL in nicht-CF-Kulturen. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM aus n=5-Experimenten dar (2-Wege-ANOVA, Sidak es multiple Vergleiche Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Schließlich können, wie es im Protokollabschnitt 6.8 heißt, die Raten der sauren Kalkalinisierung berechnet werden, indem eine lineare Regression an die ursprünglichen Zeitpunkte nach dem Eingriff angesetzt wird. Abbildung 5A zeigt, dass das Entfernen der basolateralen HCO 3- haltige Lösung (HCO3- KRB) und deren Ersetzung durch eine HEPES-gepufferte Lösung, in Ermangelung von CO2,zu einer deutlichen Versauerung des ASL führte. Dies steht im Einklang mit dem Mangel an HCO 3- hemmend transpigem HCO3- Sekret, das die konstitutive Protonensekretion durch diese Atemwegszellen ermöglicht, ASL pH15, 17 stetig zu reduzieren. Interessanterweise war die anfängliche Versauerungsrate von Nicht-CF-Zellen deutlich langsamer als die CF-Kulturen(Abbildung 5B). Abbildung 5: Dynamische Änderungen im ASL-pH-Wert als Reaktion auf HCO3- Entfernung. (A) Repräsentative Spuren, die die Wirkung von HCO3- Entfernung auf die Kinetik des ASL pH im Laufe der Zeit in Nicht-CF und CF hAECs zeigen. Die anfänglichen Versauerungsraten wurden über die Steigung einer geraden Linie erreicht, die nach dem Entfernen von HCO3zu 7 Zeitpunkten montiert war. Die Daten stellen die Mittel ± SEM von n=6 und 7 Experimenten auf NichtCF und CF-Kulturen dar. B) Zusammenfassung der Anfangsraten der Versauerung nach HCO3- Entfernung. Die Daten stellen die Mittel ± SEM von n=6 und 7 Experimenten über NichtCF bzw. CF-Kulturen dar (Mann-Whitney-Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die dynamische Messung von ASL pH in primären menschlichen Atemweg-Epithelzellen zur Verfügung. Zu den kritischen Schritten gehören das Abwaschen des Schleims von der apischen Oberfläche der Zellen, die Messung und Subtraktion des Hintergrundes mit den gleichen Parametern wie im Experiment, die Optimierung der z-Position sowie der Gewinn und die Durchführung einer pH-Kalibrierung vor Ort.

Der erste Schritt des Waschen der Zellen ist entscheidend, da eine dicke Schleimschicht (i) verhindern kann, dass die Farbstoffe die Perimisilismisere (PCL) erreichen und (ii) die Erkennung von Veränderungen der Fluoreszenz als Reaktion auf Agonists/Inhibitoren verzögern oder verhindern. Unsere Methode wurde entwickelt, um zu untersuchen, wie primäre hAECs die Aktivität von HCO3– und H+ Transportern als Reaktion auf Agonisten moduliert. Während es interessant sein wird zu untersuchen, wie sich Veränderungen im PCL-pH-Wert auf Veränderungen im SchleimpH-Wert beziehen, ist eine Weiterentwicklung dieses Protokolls notwendig, einschließlich der Verwendung verschiedener molekularer Gewichtsdextrans, um die 2 Schichten und Z-Scans durch die Ganz ASL.

Die Hintergrundmessung ist ein weiterer wichtiger Schritt dieses Protokolls. Die apische Oberfläche der vollständig differenzierten Primärluftwege-Epithelia ist selten völlig flach, was den Lichtweg und damit den Hintergrund beeinflussen wird. Die Sicherstellung, dass die Hintergrundwerte in den gleichen lokalen Punkten der Brunnen durchgeführt werden wie während des Experiments, ist entscheidend für die Reproduzierbarkeit und Stabilität der Aufnahmen.

Die Optimierung der z-Position und des Gewinns sind notwendige Schritte, die für jede unterschiedliche Konzentration von fluoreszierenden Farbstoffen, die verwendet werden, eingerichtet werden müssen. Dadurch wird eine hohe Experimentiervariabilität verhindert. Sobald wir eingerichtet sind, liefert unser Test stabile und reproduzierbare Ergebnisse. Einer der Gründe dafür ist, dass die Farbstoffe auf der apischen Oberfläche auf den Zellen in einem kleinen Flüssigkeitsvolumen, das leicht vom Epithel wieder aufgenommen wird, zugesetzt werden, so dass ein homogen beschriftetes ASL entsteht. Eine andere Methode, um die ASL zu beflecken, die ebenso erfolgreich sein kann, verwendet trockenes Pulver oder eine “Suspendierung” in PFC. Obwohl dies zeitsparend sein könnte (da die Experimente in der Regel innerhalb von 2 Stunden durchgeführt werden), ist es unwahrscheinlich, dass die trockenen Farbstoffe vollständig in der ASL lösen und somit könnten Form Klumpen. So werden unterschiedliche Konzentrationen von pH-empfindlichen Farbstoffen über der Oberfläche der epithelialen Zellen gefunden.

Die pH-Kalibrierung in situ ist ein wichtiger Schritt, um genaue, reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Wie im Ergebnisabschnitt gezeigt und erläutert, werden sich die Unterschiede in den ASL-Volumina auf die Fluoreszenzzahlen und damit auf die interpolierten pH-Werte (Abbildung 2 und Abbildung3) auswirken. Während verschiedene Gruppen bisher ASL-pH-Messungen veröffentlicht haben, wurde auch zwischen verschiedenen Studien, die von der gleichen Gruppe8,17veröffentlicht wurden, ein breites Spektrum an Werten erreicht. Wir glauben, dass die Ergebnisse reproduzierbarer werden, wenn sie vor Ort kalibrieren. Im Vergleich zu anderen pH-Kalibrierungstechniken, die die hohe K+/nigericin-Methode(oder mehrere Ionophoren) verwenden, um die Standardkurve 28,29, 30zuerzeugen,hatder hier vorgestellte Test den Vorteil, dass Solange jeder Schritt in einem Sicherheitsschrank durchgeführt wird, können die Zellen, die für ASL pH verwendet werden, gewaschen, aufbewahrt und für andere Experimente wiederverwendet werden, sofern die durchgeführten Behandlungen die Epithelzellen nicht irreversibel beeinflussen.

Die Entwicklung und Optimierung dieses Tests hat reproduzierbare Ergebnisse geliefert, und wir glauben, dass diese Methode anderen Gruppen mit ihrer ASL-pH-Messung helfen wird. Diese Technik hat aber auch einige Einschränkungen durch die Einrichtung und die Art der Zellen, die verwendet werden. Die Überwachung des pH-pH-Wertes über einen längeren Zeitraum als der hier vorgestellte (& gt;8-10 h) könnte sich als schwierig erweisen, da eine langfristig hohe Luftfeuchtigkeit die Geräte beschädigen könnte und die Tatsache, dass die meisten Plattenleser nur die Möglichkeit bieten, kinetische Messwerte über eine Bestimmte Zeit (typischerweise 24 Stunden). Der Einsatz von vollständig differenzierten primären hAECs ist von entscheidender Bedeutung, da verschiedene Differenzierungsstufen den Ausdruck von HCO3– und H+-Transportern beeinflussen. Es gibt jedoch praktisch keine Möglichkeit, das Volumen von ASL in Zellen, die unter Dünnschichtbedingungen gewachsen sind, genau zu kontrollieren. Wie in den Protokoll-und Ergebnisabschnitten angegeben, werden sich die Volumenänderungen auf das Fluoreszenzverhältnis auswirken, und es ist leider davon auszugehen, dass in Zellen, die aus einer einzigen Person stammen, am selben Tag auf verschiedenen halbdurchlässigen Stützen, ASL-Volumina, gesät werden. Wird gleich sein. Ausgenommen aus dieser Einschränkung, wird jeder Agonist oder Inhibitor, der die Flüssigkeitssekretion oder-absorption beeinflussen wird, das ASL-Volumen und vermutlich die Fluoreszenzverhältnisse beeinflussen. In unserem Test wird die Kalibrierkurve jedoch am Ende des Experiments durchgeführt, so dass wir davon ausgehen können, dass diese Volumenänderungen die Kalibrierungsverhältnisse in der gleichen Weise beeinflussen werden wie während des kinetischen Experiments. Aus diesem Grund raten wir Gruppen, die an der Entwicklung dieses Tests interessiert wären, mindestens 2-3 Replikate pro geprüfter Bedingung zu verwenden, da dies die Einrichtung einer Standardkurve für jede Bedingung ermöglichen wird.

Hier stellen wir einen einfachen, halbautomatisierten Test vor, der eine Echtzeitmessung des pH-pH-pH-pH-Wermuttes unter Dünnschichtbedingungen ermöglicht. Sie hat die Fähigkeit, dynamische pH-Reaktionen in vielen Kulturen nahezu zeitgleich zu untersuchen, die einen Vergleich zwischen und innerhalb der Spender ermöglichen. Eine Aufwertung dieser Methode auf ein 96-Brunnenplatten-Format mit polarisiertem System (HTS 96 well plates)38 würde als Medikamentenentdeckungsuntergang noch einen noch höheren Durchsatz bieten. Darüber hinaus haben wir gezeigt, wie diese Technik verwendet werden kann, um die akute Wirkung von Agonisten auf ASLpH zuuntersuchen, und wir haben bereits veröffentlicht, dass diese Methode verwendet werden kann, um die langfristige Wirkung eines apischen Protonenpumpenhemmern auf CF hAECs ASL 39 zu untersuchen. Da sich gezeigt hat, dass pH-Wert Infektionen, Entzündungen, Schleimviskosität und Ionentransport regulieren, wird die Identifizierung molekularer Ziele, die pH-Wert erhöhen können, in den Forschungsbereichen chronischer Lungenerkrankungen wertvoll sein, und diese Technik wird potenziell die Entwicklung des Arzneimittelscreening in der personalisierten Medizin. Da die Dysregulation in der Säure-Base-Homöostase bei anderen Krankheiten eine große Rolle spielt, kann dieses Protokoll mit Optimierungsschritten an verschiedene Geräte (Plattenleser) und Zelltypen, wie andere Epithelzellen, angepasst werden. Extrakelluläre Säure ist ein Merkmal vonKrebs 40,41,42 und dieser Test könnte dabei helfen, festzustellen, wie feste Tumoren einen niedrigen pH-Wert produzieren oder als Test für ein niedrig durchlässiges Arzneimittelscreening verwendet werden könnten. Wiederherstellung der pH-Homöostase. Ebenso wie bei chronischen Atemwegserkrankungen könnte sie auch eine Plattform für die Entwicklung eines personalisierten medizinischen Ansatzes bieten.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt durch zwei Stipendien des CF Trust Strategic Research Centre (SRC003 und SRC013) und ein Stipendium des Medical Research Council (MRC) Confidence in Concept (MC_PC_15030). Unterstützt wurde JG durch ein Stipendium der Medical Research Foundation (MRF-091-0001-RG-GARNE). MB wurde unterstützt von einem Medizinischen Forschungsrat Clinician Scientist Fellowship (MR/M008797/1). IH wurde unterstützt von einem Wellcome Trust Clinical Training Fellowship (203520/Z/16/Z). Die Forschung wurde vom National Institute for Health Research Newcastle Biomedical Research Centre mit Sitz in Newcastle Hospitals NHS Foundation Trust und Newcastle University unterstützt. Die geäußerten Ansichten sind die der Autoren und nicht unbedingt die des NHS, des NIHR oder des Gesundheitsministeriums. Die Primärzellen von Dr. Randell wurden durch das Stipendium der Cystic Fibrosis Foundation (BOUCHE15R0) und das NIH-Stipendium (P30DK065988) unterstützt.

Materials

0.2 µm syringe filter Starlab E4780-1226
6.5 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert Corning 3470
CaCl2 Sigma Aldrich 21115
CFTRInh172 RnD Systems (Tocris) 3430 Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 20 µM
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
dextran-coupled pH-insensitive fluorescent dye: AlexaFluor488-dextran ThermoFisher D22910 Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL
dextran-coupled pH-sensitive fluorescent dye: pHrodo-dextran ThermoFisher P10361 Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL
D-glucose Sigma Aldrich G5767
Forskolin RnD Systems (Tocris) 1099 Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 10 µM
Greiner CELLSTAR 96 well plates Cellstar 655180
Humidity cassette TECAN 30090495
KCl Sigma Aldrich P9541
MES Sigma Aldrich M3885
MgCl2 Sigma Aldrich M1028
NaCl Sigma Aldrich S9888
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
NaHepes Sigma Aldrich H3784
Plate reader: TECAN SPARK 10M TECAN 30086375
Tris Sigma Aldrich T1503
Universal pH electrodes DJ 113 VWR 662-1385
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boucher, R. C. Human airway ion transport. Part one. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 150 (1), 271-281 (1994).
  2. Roomans, G. M., et al. Measurements of airway surface liquid height and mucus transport by fluorescence microscopy, and of ion composition by X-ray microanalysis. Journal of Cystic Fibrosis. 3, 135-139 (2004).
  3. Haq, I. J., Gray, M. A., Garnett, J. P., Ward, C., Brodlie, M. Airway surface liquid homeostasis in cystic fibrosis: pathophysiology and therapeutic targets. Thorax. 71 (3), 284-287 (2016).
  4. Martin, S. L., Saint-Criq, V., Hwang, T. C., Csanady, L. Ion channels as targets to treat cystic fibrosis lung disease. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2S), S22-S27 (2018).
  5. Garland, A. L., et al. Molecular basis for pH-dependent mucosal dehydration in cystic fibrosis airways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 15973-15978 (2013).
  6. Torres, I. M., Patankar, Y. R., Berwin, B. Acidosis exacerbates in vivo IL-1-dependent inflammatory responses and neutrophil recruitment during pulmonary Pseudomonas aeruginosa infection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (2), L225-L235 (2018).
  7. Berkebile, A. R., McCray, P. B. Effects of airway surface liquid pH on host defense in cystic fibrosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 52, 124-129 (2014).
  8. Tang, X. X., et al. Acidic pH increases airway surface liquid viscosity in cystic fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 879-891 (2016).
  9. Quinton, P. M. Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis. Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).
  10. Hunt, J. F., et al. Endogenous airway acidification. Implications for asthma pathophysiology. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161, 694-699 (2000).
  11. Kostikas, K., et al. pH in expired breath condensate of patients with inflammatory airway diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 165 (10), 1364-1370 (2002).
  12. Ojoo, J. C., Mulrennan, S. A., Kastelik, J. A., Morice, A. H., Redington, A. E. Exhaled breath condensate pH and exhaled nitric oxide in allergic asthma and in cystic fibrosis. Thorax. 60 (1), 22-26 (2005).
  13. Cho, D. Y., Hajighasemi, M., Hwang, P. H., Illek, B., Fischer, H. Proton secretion in freshly excised sinonasal mucosa from asthma and sinusitis patients. American Journal of Rhinology & Allergy. 23 (6), e10-e13 (2009).
  14. Cho, D. Y., Hwang, P. H., Illek, B., Fischer, H. Acid and base secretion in freshly excised nasal tissue from cystic fibrosis patients with DeltaF508 mutation. International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (2), 123-127 (2011).
  15. Coakley, R. D., et al. Abnormal surface liquid pH regulation by cultured cystic fibrosis bronchial epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 16083-16088 (2003).
  16. Pezzulo, A. A., et al. Reduced airway surface pH impairs bacterial killing in the porcine cystic fibrosis lung. Nature. 487 (7405), 109-113 (2012).
  17. Shah, V. S., et al. Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice. Science. 351 (6272), 503-507 (2016).
  18. Saint-Criq, V., Gray, M. A. Role of CFTR in epithelial physiology. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (1), 93-115 (2017).
  19. . ECFS Patient Registry Annual Data Report Available from: https://www.ecfs.eu/sites/default/files/general-content-images/working-groups/ecfs-patient-registry/ECFSPR_Report2016_06062018.pdf (2016)
  20. . Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry Annual Data Report 2017 Available from: https://www.cff.org/Research/Researcher-Resources/Patient-Registry/2017-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf (2017)
  21. Abou Alaiwa, M. H., et al. Neonates with cystic fibrosis have a reduced nasal liquid pH; a small pilot study. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (4), 373-377 (2014).
  22. Abou Alaiwa, M. H., et al. Ivacaftor-induced sweat chloride reductions correlate with increases in airway surface liquid pH in cystic fibrosis. JCI Insight. 3 (15), (2018).
  23. McShane, D., et al. Airway surface pH in subjects with cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 21 (1), 37-42 (2003).
  24. Schultz, A., et al. Airway surface liquid pH is not acidic in children with cystic fibrosis. Nature Communications. 8 (1), 1409 (2017).
  25. Abou Alaiwa, M. H., et al. Repurposing tromethamine as inhaled therapy to treat CF airway disease. JCI Insight. 1 (8), (2016).
  26. Ngamtrakulpanit, L., et al. Identification of Intrinsic Airway Acidification in Pulmonary Tuberculosis. Global Journal of Health Science. 2 (1), 106-110 (2010).
  27. Tate, S., MacGregor, G., Davis, M., Innes, J. A., Greening, A. P. Airways in cystic fibrosis are acidified: detection by exhaled breath condensate. Thorax. 57 (11), 926-929 (2002).
  28. Jayaraman, S., Song, Y. Airway surface liquid pH in well-differentiated airway epithelial cell cultures and mouse trachea. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 281 (5), C1504-C1511 (2001).
  29. Jayaraman, S., Song, Y., Vetrivel, L., Shankar, L., Verkman, A. S. Noninvasive in vivo fluorescence measurement of airway-surface liquid depth, salt concentration, and pH. Journal of Clinical Investigation. 107 (3), 317-324 (2001).
  30. Lennox, A. T., et al. ATP12A promotes mucus dysfunction during Type 2 airway inflammation. Scientific Reports. 8 (1), 2109 (2018).
  31. Song, Y., Thiagarajah, J., Verkman, A. S. Sodium and chloride concentrations, pH, and depth of airway surface liquid in distal airways. The Journal of General Physiology. 122 (5), 511-519 (2003).
  32. Thiagarajah, J. R., Song, Y., Haggie, P. M., Verkman, A. S. A small molecule CFTR inhibitor produces cystic fibrosis-like submucosal gland fluid secretions in normal airways. FASEB Journal. 18 (7), 875-877 (2004).
  33. Garnett, J. P., et al. Hyperglycaemia and Pseudomonas aeruginosa acidify cystic fibrosis airway surface liquid by elevating epithelial monocarboxylate transporter 2 dependent lactate-H(+) secretion. Scientific Reports. 6, 37955 (2016).
  34. Gorrieri, G., et al. Goblet Cell Hyperplasia Requires High Bicarbonate Transport To Support Mucin Release. Scientific Reports. 6, 36016 (2016).
  35. Randell, S. H., Fulcher, M. L., O’Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods in Molecular Biology. 742, 285-310 (2011).
  36. Fulcher, M. L., Randell, S. H. Human nasal and tracheo-bronchial respiratory epithelial cell culture. Methods in Molecular Biology. , 109-121 (2013).
  37. Matsui, H., et al. Evidence for periciliary liquid layer depletion, not abnormal ion composition, in the pathogenesis of cystic fibrosis airways disease. Cell. 95 (7), 1005-1015 (1998).
  38. Ahmadi, S., et al. Phenotypic profiling of CFTR modulators in patient-derived respiratory epithelia. npj Genomic Medicine. 2, 12 (2017).
  39. Delpiano, L., et al. Esomeprazole Increases Airway Surface Liquid pH in Primary Cystic Fibrosis Epithelial Cells. Frontiers in Pharmacology. 9, 1462 (2018).
  40. Gillies, R. J., Liu, Z., Bhujwalla, Z. 31P-MRS measurements of extracellular pH of tumors using 3-aminopropylphosphonate. American Journal of Physiology. 267 (1 Pt 1), C195-C203 (1994).
  41. Tannock, I. F., Rotin, D. Acid pH in tumors and its potential for therapeutic exploitation. Cancer Research. 49 (16), 4373-4384 (1989).
  42. Wike-Hooley, J. L., Haveman, J., Reinhold, H. S. The relevance of tumour pH to the treatment of malignant disease. Radiotherapy and Oncology. 2 (4), 343-366 (1984).

Tags

Real-timeSemi-automatedFluorescent MeasurementAirway Surface Liquid PHPrimary Human Airway Epithelial CellsIon ChannelsTransportersExtracellular PH RegulationCystic FibrosisAsthmaCOPDAir-liquid InterfaceBicarbonate BufferPlate ReaderTemperature ControlCarbon Dioxide ControlHumidity CassetteKinetic Loop

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Saint-Criq, V., Haq, I. J., Gardner, A. I., Garnett, J. P., Ward, C., Brodlie, M., Gray, M. A. Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (148), e59815, doi:10.3791/59815 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image