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Biochemistry

Misurazione fluorescente semi-automatizzata in tempo reale del pH liquido superficiale delle vie respiratorie delle cellule epiteliali delle vie respiratorie umane primarie

Published: June 13, 2019
doi:
10.3791/59815
, , , , , ,
1Epithelial Research Group, Institute for Cell and Molecular Biosciences, Faculty of Medical Sciences,Newcastle University, 2Respiratory Group, Institute of Cellular Medicine, Faculty of Medical Sciences,Newcastle University, 3Paediatric Respiratory Medicine, Great North Children’s Hospital,Newcastle upon Tyne Hospitals NHS Foundation Trust, 4Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co

Summary

Presentiamo un protocollo per effettuare misurazioni dinamiche del pH liquido superficiale delle vie respiratorie in condizioni di pellicola sottile utilizzando un lettore di piastre.

Abstract

Negli ultimi anni, l’importanza del pH superficiale delle mucose nelle vie respiratorie è stata evidenziata dalla sua capacità di regolare l’idratazione del liquido superficiale delle vie respiratorie (ASL), la viscosità del muco e l’attività dei peptidi antimicrobici, i parametri chiave coinvolti nella difesa innata del Polmoni. Questo è di primaria importanza nel campo delle malattie respiratorie croniche come la fibrosi cistica (FC) dove questi parametri sono disregolati. Mentre diversi gruppi hanno studiato l’ASL pH sia in vivo che in vitro, i loro metodi riportano una gamma relativamente ampia di valori di pH ASL e anche risultati contraddittori per quanto riguarda le differenze di pH tra le cellule non CF e CF. Inoltre, i loro protocolli non sempre forniscono dettagli sufficienti al fine di garantire la riproducibilità, la maggior parte sono a basso throughput e richiedono attrezzature costose o conoscenze specializzate per implementare, rendendoli difficili da stabilire nella maggior parte dei laboratori. Qui descriviamo un saggio semi-automatizzato di lettori di piastre fluorescenti che consente la misurazione in tempo reale del pH ASL in condizioni di pellicola sottile che assomigliano più strettamente alla situazione in vivo. Questa tecnica consente misurazioni stabili per molte ore da diverse colture di vie aeree simultaneamente e, soprattutto, cambiamenti dinamici nel pH ASL in risposta a agonisti e inibitori possono essere monitorati. Per raggiungere questo obiettivo, l’ASL delle cellule epiteliali umane primarie completamente differenziate (hAECs) viene macchiata durante la notte con un colorante sensibile al pH per consentire il riassorbimento del fluido in eccesso per garantire condizioni di film sottili. Dopo che la fluorescenza è monitorata in presenza o assenza di agonisti, la calibrazione del pH viene eseguita in situ per correggere il volume e la concentrazione di colorante. Il metodo descritto fornisce i controlli necessari per rendere le misurazioni di pH ASL stabili e riproducibili, che in ultima analisi potrebbero essere utilizzate come piattaforma di scoperta di farmaci per la medicina personalizzata, nonché adattate ad altri tessuti epiteliali e sperimentazioni sperimentali come ad esempio i modelli infiammatori e/o i patogeno dell’ospite.

Introduction

L’epitelio delle vie respiratorie è coperto da uno strato fluido sottile (~ 10 μm) definito il liquido superficiale delle vie respiratorie (ASL). La composizione e la profondità (idratazione) di questa ASL è strettamente regolata e controlla l’efficienza del gioco delle vie aeree da parte della escalatore mucociliare1,2,3,4. Negli ultimi anni, l’importanza dell’ASL H+/HCO3– content è stata dimostrata da diversi gruppi grazie alla sua capacità di regolare l’idratazione ASL5, l’infiammazione delle vie respiratorie6 e l’infezione7, 8 così come la viscosità del muco8,9. È importante sottolineare che, sebbene esistano alcune controversie, molti studi hanno riportato una disregolazione del pH delle vie respiratorie nelle malattie croniche delle vie respiratorie come asma10,11,12, BPCO11, bronchiectasie11, rhinosinusite cronica13,14 e fibrosi cistica (CF)5,9,15,16,17, che suggerisce che le terapie che ripristinano il pH dell’ASL potrebbero essere utili per trattare più tipi di malattie croniche delle vie respiratorie. La CF è la malattia genetica autosomica recessiva più comune nelle popolazioni caucasiche ed è dovuta a mutazioni nel gene del regolatore della conduttanza transmembrana CF (CFTR). Questo gene codifica un anione (HCO3– e CL–) canale che svolge un ruolo cruciale nel trasporto di ioni e fluidi e l’omeostasi attraverso l’epitelio18. Anche se CF è una malattia multi-organo, la patologia polmonare è la principale causa di morbilità e mortalità19,20 e considerando il difetto primario in CF è un trasporto alterato di CL– e HCO3–, si può ipotizzare che il pH del fluido extracellulare nelle persone con FC sarà disregolato rispetto alle persone che non hanno CF. Pertanto, la misurazione del pH ASL è stata un’area topica della ricerca CF e diversi gruppi hanno sviluppato tecniche per misurare il pH dell’ASL in CF Airways.

In vivo, il pH delle vie respiratorie è stato misurato utilizzando diverse tecniche, da micro-sonde (sonde a fibra ottica, oro o mobidium)5,21,22,23,24 a misurazioni di pH di materiale espettorato o condensa espirata (EBC)10,11,12,25,26,27. Nel campo della ricerca di FC, il pH è ampiamente studiato a causa delle sue potenziali implicazioni cliniche. Teoricamente, rendere le vie aeree più alcaline potrebbe aumentare l’uccisione batterica e migliorare la clearance mucociliare e l’omeostasi delle vie respiratorie nel suo complesso. Tuttavia, gli studi in vivo/ex vivo riportano una vasta gamma di valori di pH, e fino ad oggi, i risultati non sono conclusivi per quanto riguarda l’esistenza di una differenza di pH tra le vie aeree non-CF e CF. Nei primi anni 2000, diversi gruppi hanno riferito il pH dell’EBC. Nei gruppi non malati, i valori di pH andavano da 4,6 a 8,5 ma è interessante notare che l’EBC pH è stato trovato più acido durante le esacerbazioni nelle persone con CF12,27. Più recentemente, le misurazioni in vivo della ASL in modelli umani e animali di CF hanno riportato risultati contrastanti16,17,21,22,23, 24 e non è ancora chiaro se le vie aeree CF sono più acide rispetto alle vie aeree non CF.

Poiché la misura in vivo del pH inferiore dell’ASL si è dimostrata difficile a causa della piccolissima quantità di fluido che riveste le vie respiratorie e della potenziale presenza di spine di muco nella malattia, molti gruppi si sono rivolti a esperimenti in vitro per misurare il pH dell’ASL, utilizzando principalmente tre diversi Metodologie. Il primo approccio utilizza coloranti fluorescenti sensibili al pH con impermeabilità di Dextran, che vengono aggiunti come polvere secca, direttamente all’ASL o utilizzando un fluido inerte chiamato fluorocarboniche (PFC)5,8,16 , 17 anni di , 28 il , 29 il , 30 il , al 31 , 32. Tuttavia, questa tecnica fornisce scarso controllo sulla quantità esatta di colorante che viene aggiunto alle colture e presenta un rischio di aggregati di colorante e grandi differenze di concentrazione tra campioni e/o esperimenti e anche all’interno dello stesso campione . Inoltre è stato generalmente eseguito con un microscopio confocale, che ne limita l’applicabilità e in molti casi, previene il monitoraggio dettagliato di campioni multipli e cambiamenti nelle condizioni di registrazione. Il secondo metodo impiegato per misurare il pH dell’ASL è l’uso di microelettrodi sensibili al pH5,15. Le misurazioni del pH delle ASL non dipendono quindi dalla concentrazione di colorante fluorescente e devono fornire risultati più robusti e riproducibili. Tuttavia, questo metodo non consente misurazioni dinamiche in tempo reale del pH ASL, né è facile effettuare più letture in condizioni diverse. È anche un processo complesso e laborioso che richiede attrezzature specializzate (microelettrodi di fabbricazione/dispositivi di registrazione elettrofisiologica) e formazione per la raccolta dei campioni per la successiva misurazione e calibrazione del pH. Inoltre, queste due tecniche hanno mostrato anche alcune incongruenze nella capacità di produrre risultati riproducibili: utilizzando il metodo del colorante fluorescente sensibile al pH, Tang et al. valori riferiti di 7,35 per le ASL non CF e 7,0 per CF ASL8 considerando che in un recente documento dello stesso gruppo, l’ASL pH era 6,9 e 6,4 per i non-CF e CF, rispettivamente17. In modo analogo, le misurazioni dei microelettrodi hanno dato valori di 6,4 in non-CF ASL e 6,1 in FC ASL in uno studio da 200315 mentre lo stesso gruppo ha riferito valori di 6,7 per non-CF asl e 6,45 per FC ASL in uno studio da 20135. Infine, nel terzo approccio, i ricercatori aggiungono un volume relativamente grande di soluzione debolmente tamponata sulla superficie apicale (mucosa) delle colture, distruggendo così le condizioni del film sottile e alterando la composizione delle ASL, e potenzialmente la sua regolazione. il pH viene quindi misurato utilizzando coloranti fluorescenti sensibili al pH33, mediante un metodo di titolazione pH-Stat in una camera di Ussing13,14, o richiede che la SLM diluita venga rimossa dalle colture e il pH misurato utilizzando un pH elettrodo, analizzatore o strisce di tornasole34. Un’altra difficoltà nella misurazione accurata del pH dell’ASL è la creazione di una curva standard che sia la più precisa possibile. Infatti, se le letture vengono eseguite con un elettrodo che misurerà la differenza di potenziale elettrico attraverso una resina o utilizzando coloranti fluorescenti sensibili al pH, entrambi questi approcci saranno influenzati dal microambiente locale dei campioni in fase di misurato. Più precisamente, la costante di dissociazione (KD) dei coloranti può variare considerevolmente a seconda della temperatura, della forza ionica, della viscosità e delle potenziali interazioni del colorante con i costituenti cellulari come le proteine e potenzialmente il muco.

Al fine di cercare di superare molti di questi problemi tecnici, oltre a sviluppare un metodo di throughput più dinamico, più semplice e più elevato, abbiamo stabilito una tecnica in vitro che registra il pH dell’ASL nelle colture primarie dell’hAEC utilizzando una cellula-sensibile al pH colorante fluorescente in un normale lettore di lastre commerciali. Il metodo genera misurazioni riproducibili, dinamiche, semiautomatizzate e in tempo reale del pH ASL di colture cellulari 3D completamente differenziate in condizioni di pellicola sottile. Attraverso l’uso di un lettore di piastre a più pozzetti, questo saggio semi-automatizzato può effettuare misurazioni quasi simultanee di pH per un massimo di 24 condizioni su 12 h e può monitorare l’effetto dell’aggiunta di vari agonisti o inibitori. In questo documento Descriviamo la metodologia in dettaglio e riportiamo i risultati rappresentativi in condizioni di controllo positive e negative che convalidano la tecnica.

Protocol

Primaria non-CF (n = 3 donatori, Età 34, 27 e 23 anni) e CF (n = 3 donatori, tutti F580del/F508del; età 40, 41, sconosciuto) haecs erano un regalo gentile da Dr. Scott H. Randell (Marsico Lung Institute, l’Università della Carolina del Nord a Chapel Hill, Stati Uniti) e sono stati recare con protocollo #03-1396 approvato dall’Università della Carolina del Nord presso il Comitato di riesame istituzionale di Chapel Hill Biomedical. Le cellule sono state coltivate secondo metodi precedentemente pubblicati utilizzando i media di crescita e differenziazione descritti da Fulcher e Randell35,36. 1. preparazione del campione Coltivare haecs primari su supporti semi-permeabili di diametro 6,5 mm (tabella dei materiali) all’interfaccia aria-liquido per almeno 28 giorni, come descritto in precedenza35,36. Preparare 50 ml di soluzione sterile di soluzione tampone Krebs contenente HCO3 (HCO3- KRB, le concentrazioni sono riportate in mm NaHCO3 (25) NaCl (115), KCl (5), CAcl2 (1), MgCl2 (1), D-glucosio (5)) sterilizzare con un filtro per siringa da 0,2 μm. Cambiare il medium basolaterale su mezzo di differenziazione fresco come descritto in 1,135,36.Nota: è stato dimostrato che la concentrazione basolaterale del glucosio influisce sull’ASL pH33. In questa fase, il contenuto di glucosio del compartimento basolaterale può essere controllato sostituendo il mezzo con soluzioni tamponata di concentrazioni di glucosio conosciute. Lavare la superficie apicale delle cellule aggiungendo 150 μl di HCO3- KRB e incubare per 20 minuti a 37 ° c, 5% Co2. Rimuovere il lavaggio apicale senza interrompere l’epitelio aspirando con cautela utilizzando un vetro sterile Pipet Pasteur e una punta Pipet sterile P200 collegata a una pompa di aspirazione che crea un vuoto nella bottiglia di raccolta. In questa fase, ci dovrebbe essere come poco liquido rimanente sulla superficie apicale possibile per ripristinare l’interfaccia aria-liquido. Incubare le cellule per altri 30 min a 37 ° c, 5% CO2. 2. misurazione dello sfondo Accendere il lettore di piastre e il computer. Aprire il dashboard. Fare clic su Spark 10m, aprire il controllo della temperatura e impostare a 37 ° c. Aprire il controllo del gas e impostare il CO2 al 5%. Attendere fino a quando la temperatura e CO2 hanno raggiunto i loro obiettivi. Aprire il cassetto del lettore di piastre, inserire la cassetta di umidità riempita con 6 mL di dH2O su ogni lato. Assicurarsi che il coperchio e il fondo della piastra siano puliti – in caso contrario, pulire con 70% di etanolo su un pezzo di tessuto-e posizionare la piastra nella cassetta di umidità.Nota: durante l’esperimento, il coperchio della piastra di coltura tissutale viene mantenuto sulla piastra e rimosso solo quando si aggiungono farmaci o si cambia il mezzo basolaterale, che vengono eseguiti in una cappa a flusso laminare per colture tissutali per mantenere le colture in un ambiente sterile. Aprire l’editor metodo Spark e impostare i parametri sul software come segue: Selezionare il modello di piastra appropriato (per supporti semi-permeabili di diametro 6,5 mm, selezionare la piastra a 24 pozzetti) e i pozzetti che verranno monitorati durante questo esperimento. Aggiungere una temperatura e un pannello di controllo CO2 e impostarli rispettivamente a 37 ° c e al 5%. Spuntare l’ attesa per le scatole di temperatura/gas . Aggiungere un pannello ciclo cinetico e selezionare la durata come tipo di loop e impostarla su 5-10 min. scegliere non definito come tipo di intervallo per abilitare la lettura continua.Nota: il tempo di lettura continua dipende dal numero di pozzetti/condizioni. 5 min è abbastanza lungo per 6-12 pozzi mentre una piastra completa contenente 24 condizioni richiederà 10 minuti di misurazioni continue. All’interno del ciclo cinetico, aggiungere due pannelli “intensità di fluorescenza”, utilizzando la funzione di trascinamento della selezione, che verrà impostato per i coloranti fluorescenti sensibili al pH e al pH rispettivamente. Impostare lunghezze d’onda di eccitazione e di emissione a 560 e 590 nm, rispettivamente, per il colorante sensibile al pH e 495 e 520 nm, rispettivamente, per il colorante insensibile al pH. Impostare il numero di lampeggi su 30 e la posizione z su 33200 per ogni fluoroforo.Nota: le impostazioni di posizione z e guadagno dipendono dalle caratteristiche del lettore di piastre. Impostare il guadagno manualmente su un valore che darà conteggi abbastanza alto in modo che le differenze tra i campioni saranno prelevati ma abbastanza basso in modo che l’aggiunta di un agonista non genererà valori fuori dalla gamma di rilevamento. Impostare la lettura multipla per pozzo per l’utente definito come un tipo di cerchio di 3 × 3 dimensioni con un bordo di 4750 μm. Fare clic sul pulsante di avvio per effettuare una misurazione di sfondo e OK per confermare il coperchio della cassetta di umidità è in posizione. Al termine della misurazione, aprire il cassetto del lettore di piastre, togliere la piastra e Pcollocare la cella nell’incubatrice durante la preparazione della soluzione di miscela di colorante fluorescente. Preparare la soluzione di miscela di colorante fluorescente aggiungendo 2 μl di colorante fluorescente da 1 mg/ml di Dextran accoppiato al pH (phsens) a 0,2 μl di colorante fluorescente da 10 mg/ml di Dextran accoppiato al pH (Phins) e 0,8 μl di HCO3- KRB sterile per un finale volume di 3 μL per condizione.Nota: il volume totale della soluzione di miscela colorante deve essere preparato per n pozzi + 1 se ci sono tra 1 e 10 campioni, o n pozzi + 2 se ci sono tra 11 e 24 campioni. I coloranti accoppiati con dextran sono ricostituiti in soluzione HCO3- KRB filtrata-sterile, aliquotato e conservato a-20 ° c. Qualsiasi sostanza chimica può essere aggiunta in questa fase per un periodo di incubazione di 16-24 h37 sulla superficie apicale. Le sostanze chimiche devono essere preparate come 0,1 x, poiché il volume finale, dopo l’assorbimento del fluido in eccesso da parte della coltura, sarà di circa 0,3 μL per un supporto semi-permeabile di diametro 6,5 mm. Aggiungere con cautela 3 μL di miscela colorante (vedere 2,8) alla superficie apicale delle cellule e incubare durante la notte a 37 ° c, 5% CO2. 3. misurazione cinetica Ripetere i passaggi da 2,1 a 2,4 per preparare il lettore di piastre. Fare clic sull’icona Apri e selezionare il file di metodo utilizzato per le misurazioni di sfondo Nel pannello ciclo cinetico, Mantieni il tipo di loop come Duration e impostalo su 08 ore. Modificare il tipo di intervallo su fisso e impostarlo su 5 minuti. Mantenere i pannelli di intensità di fluorescenza uguali a quelli delle misurazioni di sfondoNota: il tipo di intervallo per le misurazioni di sfondo è impostato su “non definito” per consentire la lettura continua. Per esperimenti cinetici come pure e calibrazione, il tipo di intervallo è impostato su “fisso” con un intervallo di 5 min. Questo può essere regolato in base alla progettazione dell’esperimento e al numero di condizioni. Aprire il cassetto del lettore di piastre; Inserire la cassetta di umidità riempita con 6 mL di dH2O su ciascun lato. Assicurarsi che il coperchio e il fondo della piastra siano puliti – in caso contrario, pulire con 70% di etanolo su un pezzo di tessuto-e posizionare la piastra nella cassetta di umidità, con la sua copertura. Avviare le letture di fluorescenza facendo clic su Start. Fare clic su OK dopo aver assicurarsi che il coperchio della cassetta di umidità sia in posizione. Dopo n cicli, di solito tra 12 e 24, che equivale a 1 a 2 ore, fare clic su pausa per interrompere l’esperimento. Togliere la piastra e applicare qualsiasi farmaco/agonista basolateralmente ai diversi campioni.Nota: quando le cellule vengono prese fuori dal lettore di piastre, CO2 sfugge e questo induce un aumento del pH ASL come mostrato da un calo della fluorescenza colorante sensibile al pH. Questa variazione di pH indotta da CO2inverte entro 10-15 min dopo aver riposizionato le colture nel lettore di piastre. Rimettere la piastra nella cassetta di umidità sul vassoio, riposizionare il coperchio della cassetta dell’umidità e fare clic su continua per registrare ulteriormente il pH dell’ASL e monitorare l’effetto dei farmaci/agonisti sul pH dell’ASL. 4. calibrazione del pH in situ Togliere la piastra dal lettore di piastre. Aspirare il supporto/soluzione basolaterale. Aggiungere 750 μL e 1 μL di soluzioni a curva standard altamente tamponata al comparto basolaterale e alla superficie apicale, rispettivamente.Nota: le soluzioni a curva standard altamente momoria senza buffer contengono (in mm) NaCl (86), KCl (5), CAcl2 (1,2), MgCl2 (1,2), nahepes o MES o tris (100 mm). Utilizzare il MES per soluzioni tampone con un pH inferiore a 7, NaHEPES per soluzioni di pH 7-7.5 e tris per soluzione con pH 8. Fissare il pH al valore desiderato utilizzando HCl. Spegnere il CO2 sul lettore di piastre o impostarlo su 0,1% e riportare la piastra nella cassetta di umidità. Impostare il lettore di piastre con gli stessi parametri descritti in precedenza ma senza CO2 come nel passaggio 3,2. Iniziare letture di fluorescenza, ogni 5 min per 1-1.5 h. 5. valutazione dell’effetto della concentrazione del colorante e del volume delle sospensioni sui dati di calibrazione Preparare una miscela di colorante sensibile al pH e insensibile sufficiente per registrare la fluorescenza ad un minimo di 4 diversi valori di pH in 3 diversi volumi.Nota: in questo caso, il mix 1 è stato preparato con 26 μL di sensibilità al pH (1 mg/mL) e 2,6 μL di insensibilità al pH (10 mg/mL) e miscelare 2 con 13 μL di sensibilità al pH (1 mg/mL) e 1,3 μL di insensibile al pH (10 mg/mL). Distribuire 2,2 μL o 1,1 μL di miscela 1 o miscelare 2, rispettivamente, in 12 pozzetti di una piastra di pozzetto 96 e aggiungere soluzioni di calibrazione sufficienti per ottenere volumi finali di 50, 100 o 200 μL e mescolare bene.Nota: in questo set up, i conteggi di fluorescenza saranno registrati per le concentrazioni di coloranti di 5 μg/mL (in 200 μL), 10 μg/mL (in 100 o 200 μL), 20 μg/mL (in 50 o 100 μL) o 40 μg/mL (in 50 μL). Accendere il lettore di piastre, impostare la temperatura a 37 ° c e inserire la piastra nel lettore di piastre. Non accendere il controller CO2 .Nota: poiché si tratta di un breve esperimento e richiede solo tempo sufficiente per equilibrare la temperatura, la cassetta di umidità non è necessaria. Regolare la posizione z e il guadagno per la piastra pozzetto 96 e utilizzare gli stessi parametri per l’esperimento fatto su supporti semi-permeabili. 6. analisi dei dati Salvare tutti i dati in fogli di calcolo e creare un nuovo file. Nel file di sfondo, selezionare tutti i dati medi per ogni campione/condizione per entrambe le lunghezze d’onda, copiare e incollare nel nuovo file. Calcola lo sfondo medio per ogni pozzo e ogni lunghezza d’onda. Ripeterlo con i dati di calibrazione e cinetica e sottrarre lo sfondo da ogni punto dati per ogni lunghezza d’onda. Per ogni punto temporale e ogni campione, calcolare il rapporto tra la fluorescenza sensibile al pH e le Se tutti i campioni sono stati ottenuti da un singolo donatore, calcolare la media dei rapporti in ogni punto temporale della curva di calibrazioneNota: è importante generare tante curve di calibrazione come donatori o soluzioni basolaterali. Infatti, questi parametri possono influenzare le letture di sfondo o il tasso di assorbimento del fluido, che a sua volta influenzerà la concentrazione di colorante e quindi il pH calcolato. Per ogni punto temporale, generare una curva standard dai rapporti, tracciando i valori di pH noti sull’asse x e i rapporti sull’asse y. Determinare il punto temporale in cui i rapporti sono stabili, adattare una linea di regressione lineare e ottenere l’equazione per questa linea. Dai dati cinetici, calcolare il pH per ogni punto temporale e tracciare il pH sull’asse y e il tempo sull’asse xNota: il pH di riposo/basale può essere calcolato calcolando i punti dati sulla misurazione stabile del pH prima dell’aggiunta di qualsiasi agonista o di qualsiasi altro intervento. L’effetto di un agonista può essere caratterizzato calcolando la differenza di pH prima e dopo (un certo periodo di tempo) il trattamento o adattando una curva non lineare ai punti dati direttamente dopo l’intervento. Questo fornirà ulteriori informazioni sul t1/2 e il valore massimo. Infine, i tassi di acidificazione o alcalinizzazione possono essere ottenuti anche dalla pendenza di una linea retta montata ai primi punti dopo l’intervento.

Representative Results

La tecnica descritta sopra consente la misurazione dinamica del pH dell’ASL in un massimo di 24 colture hAECs primarie distinte. La Figura 1 Mostra uno schema dei passi principali e delle attrezzature impostate. Le celle caricate durante la notte sono collocate in un lettore di piastre CO2 e a temperatura controllata, in cui vengono registrate ogni 5 minuti la fluorescenza dai coloranti sensibili al pH e ai pH. Figura 1: schema del metodo di misurazione del pH dell’ASL. Dopo aver lavato le colture e aver eseguito una lettura di fondo, le cellule epiteliali delle vie aeree umane primarie (hAECs) ASL sono caricate con miscela di colorante destrano accoppiato pH-sensibile e insensibile al pH durante la notte a 37 ° c, 5% CO2. Il giorno seguente, la piastra viene trasferita a una temperatura e il lettore di piastre CO2controllato e la fluorescenza da entrambi i coloranti viene registrata nel tempo. Dopo l’esperimento, viene eseguita una calibrazione in situ e i dati analizzati e presentati come pH ASL nel tempo. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra. In primo luogo, abbiamo studiato l’effetto di diversi volumi e concentrazioni di colorante sui conteggi di fluorescenza e quindi sul rapporto di 560/495. Infatti, lo scopo di aggiungere il pH-insensibile al colorante sensibile al pH è quello di correggere per la variabilità nel carico ASL. Tuttavia, era importante testare questa ipotesi e valutare se potevamo usare una curva di calibrazione standard eseguita in assenza di celle in una piastra di 96 ben per tutti gli esperimenti e i tipi di cellule. Abbiamo monitorato i conteggi di fluorescenza su 1 h in 50, 100 o 200 μl di soluzioni di calibrazione (a pH 5,5, 6,5, 7 o 8) contenenti 5, 10, 20 o 40 μg/mL di coloranti. I risultati sono presentati in Figura 2a-C, e mostrano che per lo stesso pH e la stessa concentrazione di coloranti, il rapporto di emissione phsens/Phins segnalati (560/495 sull’asse y) differito a seconda del volume (Figura 2a). Inoltre, allo stesso pH e allo stesso volume, diverse concentrazioni di colorante forniscono valori di rapporto diversi (Figura 2B). Pertanto, le variazioni di volume o concentrazione di colorante influenzeranno il valore assoluto del pH calcolato dal rapporto di emissione. La Figura 2C Mostra che il tempo necessario per l’equilibratura della temperatura è di circa 15-20 minuti. Per confermare l’effetto della concentrazione di colorante e del volume sui rapporti di emissione, abbiamo registrato la fluorescenza da coloranti caricati nella ASL dei primari non-CF e CF hAECs in situ. Abbiamo quindi eseguito la calibrazione e analizzato i risultati di (1) generando una curva standard globale da tutti i campioni o (2) generando due curve standard indipendenti per ogni tipo di cella (non-CF e CF). Il pH dell’ASL da entrambi i tipi di cellule è stato quindi tracciato contro il tempo (Figura 3A, B) e media (Figura 3C). I valori di pH delle ASL ottenuti da un’unica curva standard globale hanno evidenziato una differenza significativa tra le colture non-CF e CF (Figura 3A, C) considerando che l’ASL pH non era significativamente differente tra gli haecs FC e non-CF quando il pH veniva calcolato da curve standard indipendenti (Figura 3B, C). Questi risultati mostrano l’importanza di generare curve di calibrazione indipendenti per ogni esperimento e all’interno dell’esperimento, per ogni campione donatore, poiché quando le curve di calibrazione sono state mediate insieme, sono stati riscontrati valori di rapporto pHsens/pHins più elevati nelle colture CF , indicando un pH più acido (Figura 3C). Figura 2: ottimizzazione della calibrazione del pH in vitro. Diversi volumi di soluzioni di pH noto e contenenti diverse concentrazioni di colorante sono stati caricati su una piastra pozzetto 96 e la fluorescenza è stata registrata su 1 h. effetto del volume (a) e della concentrazione di colorante (B) sui rapporti di fluorescenza. I rapporti sono stati tracciati contro il pH per il punto temporale 24 min. (C) la pendenza di variazione della fluorescenza è stata calcolata per ogni soluzione e tracciata in funzione del tempo (in min). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra. Figura 3: ottimizzazione dell’analisi della calibrazione del pH su hAECs primari in situ. A) tracce rappresentative del pH dell’ASL ottenute da un’unica curva standard che media i dati provenienti da colture non CF e CF. B) tracce rappresentative del pH dell’ASL ottenute da curve standard indipendenti eseguite su colture non CF o CF. Ogni set di dati è stato calcolato dalla propria curva di calibrazione. C) valutazione delle differenze nel pH delle ASL tra le colture non-CF e CF in funzione del modo in cui è stata eseguita la calibrazione. I dati rappresentano la media ± SEM da n = 3 esperimenti, ANOVA a 2 vie, test di paragoni multipli di sidak). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra. Al fine di convalidare ulteriormente la nostra tecnica, abbiamo quindi richiesto un controllo positivo per dimostrare che la tecnica era in grado di rilevare un cambiamento “atteso” nel pH dell’ASL. Come la presenza di una ASL più acida nelle cellule CF è ancora controversa, abbiamo usato il forskolin agonista Camp, come una condizione di controllo positivo, per stimolare HCO3- secrezione attraverso CFTR. I risultati attesi mostrerebbero un’alcalinizzazione indotta da forskolin della ASL in cellule non-CF che sarebbe in gran parte diminuita o abolita nelle cellule CF a seconda della gravità delle mutazioni. La Figura 4a Mostra le tracce rappresentative del pH dell’ASL delle cellule non CF e CF nel tempo e la Figura 4B Mostra i dati medi del pH dell’ASL prima e dopo il trattamento con forskolin in entrambi i tipi di cellule. Possiamo ottenere informazioni diverse da questi risultati. In primo luogo, come già mostrato nella Figura 3B, C, il pH dell’ASL a riposo non era differente tra l’epitelia non-CF In secondo luogo, il primo 3-4 punti di tempo dopo aver messo in pausa l’esperimento per trattare le cellule con forskolin, ha mostrato un grande aumento di pH che recuperato entro ~ 15 min. Ciò è dovuto al calo della concentrazione di CO2 tra il lettore di piastre (5%) e il gabinetto di sicurezza della coltura tissutale (~ 0%). Secondo l’equazione di Henderson Hasselbalch, un pH di 7 in un ambiente 5% Co2 equivale ad una concentrazione di HCO3- di ~ 9,3 mm. Quando le cellule vengono rimosse dal lettore di piastre, un calo della concentrazione di CO2 allo 0% teoricamente porterà ad un aumento del pH di > 8. La Figura 4a Mostra che il pH dell’ASL è aumentato a ~ 7,8, il che può essere spiegato dal lasso di tempo che riposizionando la piastra nel lettore di piastre (cioè in un ambiente 5% Co2 ). Infine, come previsto, l’aggiunta di forskolin basolaterale da 10 μM (FSK) ha aumentato significativamente il pH dell’ASL nelle colture non-CF. Come è stato dimostrato da diversi gruppi che esiste una differenza in stato stazionario ASL pH tra CF e non-CF epithelia, abbiamo voluto indagare ulteriormente l’apparente assenza di una differenza di pH nei nostri esperimenti e il ruolo di CFTR. Per fare questo abbiamo pre-incubato colture non-CF con lo specifico inibitore CFTR, CFTRinh172 (172). Come indicato nella sezione del protocollo 2,8, il mix di coloranti è stato preparato come sopra indicato e l’inibitore è stato aggiunto ad una concentrazione di 0,1 X = 2 μM. Secondo la letteratura, l’altezza ASL delle cellule non CF è di circa 10 μm. In un supporto semi-permeabile di 6,5 mm di diametro, il volume teorico della ASL è quindi π × 3,252 = 0,3 μL. Aggiungendo 3 μL di colorante + 172 a 2 μM, la concentrazione dell’inibitore, dopo l’assorbimento del fluido in eccesso, sarà teoricamente di 20 μM (1x, concentrazione desiderata). Le tracce rappresentative nella Figura 4c e la sintesi media in Figura 4d dimostrano che 172 non ha ridotto il pH dell’ASL a riposo, ma ha impedito l’aumento indotto dal forskolin nel pH dell’ASL, confermando così i nostri risultati ottenuti da non-CF versus CF altre culture e convalidare ulteriormente la nostra tecnica. Figura 4: misurazione dinamica del pH ASL in risposta all’attivazione di CFTR da forskolin. A) tracce rappresentative dell’effetto del forskolin (FSK, 10 μm) sulla cinetica del pH dell’ASL nel tempo negli haecs non CF e CF. I dati rappresentano la media ± SEM da esperimenti n = 3. B) sintesi dell’effetto di FSK sul pH dell’ASL nelle colture non-CF e CF. I dati rappresentano la media ± DS da n = 69 colture non-CF e 35 colture CF (ANOVA a 2 vie, test di paragoni multipli di sidak). C) tracce rappresentative dell’effetto del CFTRInh172 (172 μm) sull’aumento indotto da FSK nel pH dell’ASL in non-CF haecs. I dati rappresentano la media ± SEM da esperimenti n = 5. D) sintesi dell’effetto di 172 sull’alcalinizzazione indotta da FSK della ASL nelle colture non-CF. I dati rappresentano la media ± SEM da esperimenti n = 5 (ANOVA a 2 vie, test di paragoni multipli di sidak). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra. Infine, come indicato nella sezione protocollo 6,8, i tassi di acidificazione/alcalinizzazione possono essere calcolati adattando una regressione lineare ai punti temporali iniziali dopo l’intervento. La figura 5a Mostra che la rimozione della soluzione contenente HCO3 basolaterale (HCO3- KRB) e la sua sostituzione con una soluzione tamponata con HEPES, in assenza di co2, hanno indotto una marcata acidificazione della ASL. Questo è coerente con la mancanza di HCO3- inibendo transepiteliale HCO3- secrezione, che consente la secrezione di protoni costitutivo da queste cellule delle vie respiratorie per ridurre costantemente ASL pH15, 17. È interessante notare che il tasso iniziale di acidificazione delle cellule non-CF è stato significativamente più lento rispetto alle colture CF (Figura 5b). Figura 5: cambiamenti dinamici nel pH dell’ASL in risposta a HCO3- rimozione. A) le tracce rappresentative che mostrano l’effetto di HCO3- rimozione sulla cinetica di ASL pH nel tempo in non-CF e CF haecs. I tassi iniziali di acidificazione sono stati ottenuti tramite la pendenza di una linea retta montata su 7 punti temporali dopo la rimozione di HCO3 . I dati rappresentano i mezzi ± SEM da n = 6 e 7 esperimenti sulle colture non-CF e CF rispettivamente. B) sintesi dei tassi iniziali di acidificazione a seguito della rimozione dell’HCO3 . I dati rappresentano i mezzi ± SEM da n = 6 e 7 esperimenti su colture non-CF e CF rispettivamente (test Mann-Whitney). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Discussion

Qui forniamo un protocollo dettagliato per la misurazione dinamica del pH dell’ASL nelle cellule epiteliali delle vie respiratorie umane primarie. I passaggi critici includono il lavaggio del muco dalla superficie apicale delle cellule, la misurazione e la sottrazione dello sfondo utilizzando gli stessi parametri dell’esperimento, ottimizzando la posizione z e il guadagno e eseguendo una calibrazione del pH in situ.

Il primo passo del lavaggio delle cellule è cruciale in quanto uno spesso strato di muco potrebbe (i) impedire che i coloranti raggiungano lo strato periciliario (PCL) e (II) ritardino o impediscano la rilevazione di alterazioni della fluorescenza in risposta agli agonisti/inibitori. Il nostro metodo è stato sviluppato per studiare come gli haecs primari hanno modulato l’attività dei trasportatori HCO3– e H+ in risposta agli agonisti. Mentre sarà interessante indagare su come i cambiamenti nel pH PCL si riferiscono a cambiamenti nel pH del muco, è necessario un ulteriore sviluppo di questo protocollo, compreso l’uso di diversi pesi molecolari-dextrans per colpire in modo differenziato i 2 strati e z-Scan attraverso il tutta la ASL.

La misurazione dello sfondo è un altro passo importante di questo protocollo. La superficie apicale di epitelia primario completamente differenziato delle vie aeree è raramente completamente piatta che influenzerà il percorso della luce e quindi lo sfondo. Garantire che le letture di sfondo siano eseguite negli stessi punti locali dei pozzi come durante l’esperimento è fondamentale per la riproducibilità e la stabilità delle registrazioni.

L’ottimizzazione della posizione z e del guadagno sono passi necessari che devono essere impostati per ogni diversa concentrazione di colorante fluorescente che verrà utilizzato. Ciò impedirà un’elevata variabilità inter-sperimentale. Una volta impostato, il nostro saggio fornisce risultati stabili e riproducibili. Uno dei motivi di questo è che i coloranti vengono aggiunti sulla superficie apicale sulle cellule in un piccolo volume di fluido che viene facilmente riassorbito dall’epitelio, lasciando una ASL omogeneamente etichettata. Un altro metodo per macchiare la ASL, che può essere altrettanto successo, usato polvere secca o una “sospensione” in PFC. anche se questo potrebbe essere risparmio di tempo (come gli esperimenti sono di solito eseguiti entro 2 h), è improbabile che i coloranti secchi completamente solubilizzare nella ASL e quindi potrebbe formare grumi. Così diverse concentrazioni di colorante sensibile al pH si trovano sulla superficie delle cellule epiteliali.

La calibrazione del pH in situ è un passo importante per ottenere risultati accurati e riproducibili. Come mostrato e spiegato nella sezione dei risultati, le differenze nei volumi delle ASL influenzeranno i conteggi di fluorescenza e quindi i valori di pH interpolati (Figura 2 e Figura 3). Mentre diversi gruppi hanno precedentemente pubblicato misurazioni di pH ASL, è stata ottenuta una vasta gamma di valori anche tra diversi studi pubblicati dallo stesso gruppo8,17. Crediamo che eseguendo calibrazioni in situ, i risultati diventeranno più riproducibili. Rispetto ad altre tecniche di calibrazione del pH, che utilizzano ilmetodo di alta K+/Nigericina (o più ionofori) per generare la curva standard28,29,30, il saggio presentato qui ha il vantaggio che , purché ogni fase venga eseguita in un armadio di sicurezza, le cellule utilizzate per il pH dell’ASL possono essere lavate, tenute e riutilizzate per altri esperimenti, purché i trattamenti eseguiti non influenzino irreversibilmente le cellule epiteliali.

Lo sviluppo e l’ottimizzazione di questo saggio ha fornito risultati riproducibili e crediamo che questo metodo aiuterà altri gruppi con la loro misura di pH ASL. Tuttavia, questa tecnica ha anche alcune limitazioni dovute all’impostazione e al tipo di celle utilizzate. Il monitoraggio del pH dell’ASL per un periodo di tempo più lungo rispetto a quello presentato qui (> 8-10 h) potrebbe risultare difficile in quanto un ambiente ad alta umidità a lungo termine potrebbe danneggiare l’apparecchiatura e il fatto che la maggior parte dei lettori di piastre offra solo la possibilità di registrare letture cinetiche su un un certo lasso di tempo (tipicamente 24 ore). L’uso di haecs primari completamente differenziati è cruciale nel modo in cui le diverse fasi di differenziazione influenzeranno l’espressione dei trasportatori HCO3 e H+ . Tuttavia, non c’è praticamente alcuna possibilità di controllare con precisione il volume della ASL nelle cellule coltivate in condizioni di film sottili. Come indicato nelle sezioni protocollo e risultati, le variazioni di volume influenzeranno il rapporto di fluorescenza ed è purtroppo necessario presumere che nelle cellule coltivate da un singolo individuo, seminate lo stesso giorno su diversi supporti semi-permeabili, volumi ASL sarà lo stesso. Derivante da questa limitazione, qualsiasi agonista o inibitore che influirà sulla secrezione o sull’assorbimento dei fluidi influenzerà il volume dell’ASL e presumibilmente i rapporti di fluorescenza. Tuttavia, nel nostro saggio, la curva di calibrazione viene eseguita alla fine dell’esperimento, quindi possiamo presumere che questi cambiamenti di volume influenzeranno i rapporti di calibrazione nello stesso modo come durante l’esperimento cinetico. Per questo motivo si consigliano gruppi che sarebbero interessati a sviluppare questo saggio, per utilizzare almeno 2-3 repliche per condizione testato in quanto ciò consentirà la creazione di una curva standard per ogni condizione.

Qui presentiamo un saggio semplice, semi-automatizzato, che permette la misurazione in tempo reale del pH superficiale della mucosa in condizioni di pellicola sottile. Ha la capacità di indagare risposte pH dinamiche in molte culture in un modo quasi simultaneo che consente confronti Inter e intra-donatore. Upscaling questo metodo per un formato di piastra 96 bene utilizzando il sistema polarizzato (HTS 96 ben piastre)38 fornirebbe un throughput ancora più elevato come un saggio di scoperta del farmaco. Inoltre, abbiamo dimostrato come questa tecnica possa essere utilizzata per studiare l’effetto acuto degli agonisti sul pH dell’ASL e abbiamo già pubblicato che questo metodo può essere utilizzato per studiare l’effetto a lungo termine di un inibitore della pompa protonica apicale su CF hAECs ASL39. Poiché il pH ha dimostrato di regolare l’infezione, l’infiammazione, la viscosità del muco e il trasporto ionico, identificare bersagli molecolari che possono aumentare il pH sarà prezioso nei campi di ricerca delle malattie polmonari croniche e questa tecnica faciliterà potenzialmente la sviluppo di screening farmacologico negli approcci di medicina personalizzata. Infine, poiché la disregolazione nell’omeostasi acida-base svolge un ruolo importante in altre malattie, questo protocollo può essere adattato, con fasi di ottimizzazione, a diverse apparecchiature (lettori di piastre) e tipi di cellule, come altre cellule epiteliali. L’acidità extracellulare è una caratteristica del cancro40,41,42 e questo saggio potrebbe aiutare a determinare come i tumori solidi producono basso pHe o potrebbero essere usati come test di screening farmacologico a basso rendimento per ripristino dell’omeostasi del pH. Analogamente, come per le malattie croniche delle vie respiratorie, potrebbe anche fornire una piattaforma per lo sviluppo di un approccio di medicina personalizzata.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da due sovvenzioni del centro di ricerca strategico CF Trust (SRC003 e SRC013) e da un Consiglio per la ricerca medica (MRC) Confidence in concept Grant (MC_PC_15030). JG è stato sostenuto da una sovvenzione dalla Fondazione di ricerca medica (MRF-091-0001-RG-GARNE). MB è stato sostenuto da un medico di ricerca clinica scienziato clinico Fellowship (MR/M008797/1). IH è stato supportato da una Fellowship di formazione clinica Wellcome Trust (203520/Z/16/Z). La ricerca è stata sostenuta dal centro di ricerca biomedica dell’Istituto nazionale per la salute di Newcastle con sede presso la Newcastle Hospitals NHS Foundation Trust e la Newcastle University. I pareri espressi sono quelli degli autori e non necessariamente quelli del NHS, del NIHR o del dipartimento della salute. Le cellule primarie del Dr. Randell sono state sostenute dalla sovvenzione cistica della Fondazione per la fibrosi (BOUCHE15R0) e dalla sovvenzione NIH (P30DK065988).

Materials

0.2 µm syringe filter Starlab E4780-1226
6.5 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert Corning 3470
CaCl2 Sigma Aldrich 21115
CFTRInh172 RnD Systems (Tocris) 3430 Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 20 µM
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3524
dextran-coupled pH-insensitive fluorescent dye: AlexaFluor488-dextran ThermoFisher D22910 Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL
dextran-coupled pH-sensitive fluorescent dye: pHrodo-dextran ThermoFisher P10361 Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL
D-glucose Sigma Aldrich G5767
Forskolin RnD Systems (Tocris) 1099 Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 10 µM
Greiner CELLSTAR 96 well plates Cellstar 655180
Humidity cassette TECAN 30090495
KCl Sigma Aldrich P9541
MES Sigma Aldrich M3885
MgCl2 Sigma Aldrich M1028
NaCl Sigma Aldrich S9888
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
NaHepes Sigma Aldrich H3784
Plate reader: TECAN SPARK 10M TECAN 30086375
Tris Sigma Aldrich T1503
Universal pH electrodes DJ 113 VWR 662-1385
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Saint-Criq, V., Haq, I. J., Gardner, A. I., Garnett, J. P., Ward, C., Brodlie, M., Gray, M. A. Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (148), e59815, doi:10.3791/59815 (2019).
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